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2×SYBR Green PCR Master Mix 是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進行 Real Time PCR 的專用試劑。含有常溫下完全封閉 Taq 酶活性的熱啟動酶 HS Taq DNA Polymerase,能夠有效抑制低溫條件下引物非特異性退火或者引物二聚體引起的非特異性擴增，提高擴增反應(yīng)的特異性。本試劑經(jīng)過特殊配制，采用優(yōu)化配方的qPCR 專用 Buffer，大大提高了 qPCR 反應(yīng)的擴增效率和檢測靈敏度，可以在較寬的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標準曲線，準確進行定量。本試劑與多數(shù)廠家的熒光定量 PCR 儀兼容，如 Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad 和Roche 等。

產(chǎn)品組成	A4004S	A4004M
2×SYBR Green PCR Master Mix	1 mL	5×1 mL
ROX Reference Dye I（50×）	40 μl	200 μl
ROX Reference Dye II（50×）	40 μl	200 μl

儲存條件：

本產(chǎn)品-20℃保存有效期至少一年，4℃可保存3個月。解凍后應(yīng)充分混勻，避免產(chǎn)生大量氣泡。

試劑原理：

   本產(chǎn)品利用熱啟動酶 HS Taq DNA polymerase 進行 qPCR 擴增反應(yīng)，通過擴增產(chǎn)物嵌合SYBR Green I 而激發(fā)的熒光信號強度進行檢測。
1、 PCR
   PCR 法是以微量 DNA 進行目的片段擴增的方法。通過 DNA 鏈的熱變性、引物退火、DNA 聚合酶作用下引物的延伸三個步驟循環(huán)往復(fù)，可在短時間內(nèi)擴增大量 DNA 片段。
2、熒光檢出
   SYBR Green I 是一種結(jié)合與小溝中的雙鏈DNA 結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強，最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。
   SYBR Green I 可以與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，無需使用探針，即可實現(xiàn)檢測，通用性好，且靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。在定量儀器檢測過程中，可以通過測量升高溫度后熒光的變化，由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性，從而區(qū)分產(chǎn)物的熔解峰溫度而區(qū)分特異與非特異的產(chǎn)物。

使用方法：

反應(yīng)條件
1、兩步法
熱啟動：95℃ 10 分鐘；
變性：95℃ 10～20 秒；
退火/延伸：60℃ 20～60 秒。   35--45個循環(huán)
熔解曲線分析。

2、三步法
熱啟動：95℃ 10 分鐘；
變性：95℃ 10～20 秒；
退火：56-64℃ 10～30 秒；
延伸：72℃ 10～60 秒。     35--45個循環(huán)
熔解曲線分析。
對于 Roche LightCycler480，熱啟動時間應(yīng)采用 10min，ABI7500 也可以采用 5min 熱啟動。

qPCR反應(yīng)體系配制：

建議的模板量 10～100ng（基因組 DNA）或 1～10ng（cDNA 模板）。

試劑	20μl 體系	50μl 體系	終濃度
2×SYBR Green PCR Master Mix	10μl	25μl	1×
Primer 1（10μM）	0.4～2μl	1～5μl	0.2～1.0μM
Primer 2（10μM）	0.4～2μl	1～5μl	0.2～1.0μM
Template DNA	4μl	10μl	-
ROX Reference Dye（optional）	0.4μl	1μl	1×
ddH2O	Variable	Varible	-
Total volume	20μl	50μl	-

適用機型：

以下機型無需使用ROX Reference Dye校正：

Ø Roche LightCycler 480，Roche Light Cycler 96，MJ Research Chromo4，MJ Research Opticon 2，Takara TP-800，Bio-Rad iCycler iQ,Bio-Rad iCycler iQ5,Bio-Rad CFX96,Bio-Rad C1000 Thermal Cycler,Thermo Scientific Pikoreal 96,Qiagen Corbett Rotor-Gene 6000，Qiagen Corbett Rotor-Gene G,Qiagen Corbett Rotor-

Gene Q,Qiagen Corbett Rotor-Gene 3000，Mastercycler ep realplex。

以下機型進行ROX Reference Dye校正模式，需額外添加校正染料：

Ø 使用 ROX Reference Dye I（50×）的 PCR 儀（使用時終濃度為 1×）

ABI Prism 7000/7300/7700/7900，ABI Step One，ABI Step One Plus，ABI 7900HT，ABI 7900HT Fast StepOnePlus Real-Time PCR System。

Ø 使用 ROX Reference Dye II（50×）的 PCR 儀（使用時終濃度為 1×）

ABI Prism 7500，ABI Prism 7500 Fast，ABI QuantStudio DX/3/5, ABI QuantStudio 6/7/12K Flex, ABI ViiA 7, Stratagene Mx3000P/Mx 3005P/Mx 4000。

標準GMP生產(chǎn)車間：

SYBR Green PCR Master Mix 生產(chǎn)和測試：

質(zhì)量評估指標：

1、Cq值相比主流品牌差異；

2、NTC有無非特異性擴增；

3、擴增效率相比主流品牌差異；

4、模板在低拷貝極限下，特異性擴增相比主流品牌差異；

5、平臺期的熒光值相比主流品牌差異；

6、批次之間擴增曲線、溶解曲線重復(fù)性情況；

7、模擬運輸環(huán)境測試，產(chǎn)品性能重復(fù)性情況。

進行人源β-actin擴增

以人源的CDNA原液進行8倍梯度稀釋，稀釋9個點進行擴增。

NTC非特異性擴增檢測

擴增效率檢測

模擬4℃冰袋運輸4天的性能測試

測試結(jié)果描述

1、Cq值比主流品牌更優(yōu)；

2、NTC無非特異性擴增；

3、擴增效率比主流品牌更優(yōu)；

4、模板在低拷貝極限下，特異性擴增和主流品牌一致；

5、平臺期的熒光值比主流品牌更優(yōu)；

6、批次之間擴增曲線、溶解曲線表現(xiàn)穩(wěn)定；

7、模擬運輸環(huán)境測試，產(chǎn)品性能表現(xiàn)穩(wěn)定。

比對(BiWriter) 2×SYBR Green PCR試劑盒

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試劑原理：

使用方法：

適用機型：

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