• <mark id="rrqgw"></mark>

      <bdo id="rrqgw"><pre id="rrqgw"><strike id="rrqgw"></strike></pre></bdo>

      免费观看国产短视频的方法_亚洲 日韩 欧美 成人 在线观看_思思久久96热在精品国产_亚洲中文无码mv

      ?
      corning

      使用Corning? NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)試劑盒II 高效地激活和擴增人類自然殺傷細(xì)胞 應(yīng)用指南

      作者:admin 來源: 發(fā)布時間: 2019-11-24 09:42  瀏覽次數(shù):
      購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 effectnews.cn

       

      引言

      自然殺傷(NK)細(xì)胞在識別和殺死腫瘤和病毒感染的先天和后天免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵的角色。因此,已有許多研究嘗試研發(fā)在體外激活和擴增NK細(xì)胞的方法,以用于和免疫細(xì)胞相關(guān)研究,而目前的方法包括使用細(xì)胞因子、化學(xué)試劑以及飼養(yǎng)細(xì)胞1, 其中細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性中具有核心作用。據(jù)報道, IL-2、IL-12、IL-15IL-18、IL-21IFN-γ被歸類為NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增殖的活化細(xì)胞因子,并增強NK細(xì)胞對各種腫瘤的細(xì)胞毒性作用2。然而,這些激活NK細(xì)胞的細(xì)胞因子組合仍需研究人員進一步優(yōu)化。

      此應(yīng)用說明描述了使用康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II快速擴增NK 細(xì)胞的步驟,以及能驗證該試劑盒的測試方法。該測試結(jié)果顯示康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II能為研究人員制備擴增能力強、細(xì)胞活力好以及細(xì)胞毒性高的NK細(xì)胞提供支持。

      NK無血清培養(yǎng)試劑盒II中含有11 mL的包被培養(yǎng)基,150 mL 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,11,000 mL的擴增培養(yǎng)基和1個透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋。前兩個試劑被專門設(shè)計用于NK細(xì)胞的激活培養(yǎng),而擴增培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)袋則被用于擴增NK細(xì)胞。NK激活培養(yǎng)基和擴增培養(yǎng)基均是采用優(yōu)質(zhì)的試劑和符合良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)級的原料制造的。培養(yǎng)基中存在的唯一蛋白質(zhì)是可注射等級的血清白蛋白和重組人胰島素。


      結(jié)果

      NK細(xì)胞形態(tài)

      樹突狀細(xì)胞附著在培養(yǎng)瓶表面上,而NK細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)會形成較小的細(xì)胞團塊。該細(xì)胞團塊的體積會隨著細(xì)胞密度的上升而增加。圖1顯示培養(yǎng)第10天后NK細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)。NK培養(yǎng)試劑盒和NK無血清培養(yǎng)試劑盒II的培養(yǎng)液中觀察到的細(xì)胞團塊遠(yuǎn)多于競爭產(chǎn)品I和競爭產(chǎn)品Y的培養(yǎng)基中觀察到的細(xì)胞團塊。

      材料和方法

      根據(jù)說明書使用淋巴細(xì)胞分離液(康寧目錄編號:25-072-CI)將外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)從健康供體的血液中分離。

      3×107個細(xì)胞/mLPBMC懸浮于20 mL的激活培養(yǎng)基(含10%自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基)中后轉(zhuǎn)移至預(yù)包被的T-75的培養(yǎng)瓶中, 隨后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)2-3天。T-75培養(yǎng)瓶在使用前均預(yù)先以NKCC-3培養(yǎng)基進行包被。

      10 mL的激活培養(yǎng)基(含10%自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基)加入該T-75培養(yǎng)瓶中后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2天直至細(xì)胞密度達到2x106個細(xì)胞/mL以上。

      懸液在800 ×g下離心5分鐘以收集所有PBMC細(xì)胞。將沉淀的細(xì)胞重新懸浮于含10%自體血漿的NKCC-2培養(yǎng)基中,再補充5%的自體血漿,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)。每2-3天檢查細(xì)胞狀態(tài),并加入新鮮的NKCC-2培養(yǎng)基將細(xì)胞密度維持在5×1051×106個細(xì)胞

      /mL的范圍內(nèi)。培養(yǎng)14天后收集細(xì)胞進行細(xì)胞計數(shù),同時利用BD AccuriTM     C6流式細(xì)胞儀BD   Biosciences)分析細(xì)胞表面標(biāo)志物

      CD3-/CD56+)的表達。此外,該NK細(xì)胞還通過CCK-8法,以K562作為靶細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞,即E/T的比率為510)檢測其細(xì)胞的毒性殺傷能力。

       

      1.   培養(yǎng)10天后NK細(xì)胞的形態(tài)。培養(yǎng)于NK無血清培養(yǎng)試劑盒IINK培養(yǎng)試劑盒、競爭產(chǎn)品I和競爭產(chǎn)品Y10天后的NK細(xì)胞。以上為隨機選擇的照片。比例尺:200 µm。

      NK細(xì)胞的增殖和擴增

       

      對于NK細(xì)胞的增殖,如圖2和圖3所示,NK細(xì)胞在分別利用NK無血清培養(yǎng)試劑盒IINK培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)14天后擴增了230倍和200倍,總細(xì)胞數(shù)量分別為7 x 109個細(xì)胞和 6 x 109個細(xì)胞,比競爭產(chǎn)品I的培養(yǎng)試劑盒(只達到70倍的擴增)多了3倍。利用競爭產(chǎn)品Y的培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)的NK細(xì)胞呈比較差的擴增表現(xiàn),這也與其細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

       

      NK細(xì)胞的表型

      NK細(xì)胞的特異表面標(biāo)志物為CD3-/CD56+。流式細(xì)胞的分析結(jié)果 顯示使用NK無血清培養(yǎng)試劑盒II可獲得86.7%的NK陽性細(xì)胞,而使用競爭產(chǎn)品I和競爭產(chǎn)品Y的培養(yǎng)試劑盒則獲得相對較少的NK 陽性細(xì)胞(分別為66.1%和78.8%),數(shù)據(jù)如圖4所示。

       

       

      CCK-8細(xì)胞毒性

      5×105個及1×106個效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞/mL分別與1×105個靶 細(xì)胞(K562細(xì)胞)/mL96孔微孔板100 µL)中混合后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下隔夜共培養(yǎng)。分析前在每孔細(xì)胞均加入10 µL的細(xì)胞計數(shù)試劑盒8CCK-8)試劑(Sigma目錄編號:96992并進一步在37℃下孵育4小時后利用SpectraMax M4®Molecular Devices多功能微孔板檢測儀讀取吸光度數(shù)據(jù)。在E/T比例為5狀況下,康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II與競爭產(chǎn)品I70%)和競爭產(chǎn)品Y60%)相比具有更強的細(xì)胞毒性(100%)。

       

      5.CCK-8法評估NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該細(xì)胞毒性測定是在效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞)與靶細(xì)胞(K562細(xì)胞)的比例為510的情況下進行。

      結(jié)論

      使用康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II可快速激活擴增NK細(xì)胞,可獲取數(shù)量大(~70億細(xì)胞,即230倍的增殖),具有高細(xì)胞毒性效力(在E/T比例為51的狀況下達到100%的細(xì)胞毒性效力)的NK細(xì)胞。

      康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II在無其他細(xì)胞因子(如IL-2)的條件下可以獲取較高的NK細(xì)胞增殖。

      康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II具有一套完整的材料和詳細(xì)的操作程序。 

      與競爭產(chǎn)品I和競爭產(chǎn)品Y的培養(yǎng)試劑盒相比,培養(yǎng)于康寧NK 無血清培養(yǎng)試劑盒IINK細(xì)胞在生長、NK陽性細(xì)胞比率以及細(xì)胞毒性效力方面均表現(xiàn)出了更好的性能。

       

      附錄

       

      項目                  NK無血清培養(yǎng)試劑盒II

      NK培養(yǎng)試劑盒

      競爭產(chǎn)品I

      競爭產(chǎn)品Y

      4個組分:

      5 個組分:

      1個組分:

      8個組分:

      1L NKCC-2擴增培養(yǎng)基

      預(yù)包被的T75培養(yǎng)瓶

      NK培養(yǎng)基(2L/2瓶)

      NK培養(yǎng)基(2L/2瓶)

      50mL NKCC-1激活培養(yǎng)基

      1LKBM NK擴增培養(yǎng)基

       

      NK誘導(dǎo)因子(6瓶)

      1 mL NKCC-3包被培養(yǎng)基

      50 mLNK基礎(chǔ)培養(yǎng)基

       

       

      項目                                       透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋

      1.8 mL的基礎(chǔ)添加試劑

       

       

       

      透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋

       

       

      產(chǎn)品包裝體積                                     1L

      1L

      1L

      2L

      PBMC的細(xì)胞接種數(shù)量                   30 千萬

      30 千萬

      30 千萬

      30 千萬

      培養(yǎng)天數(shù)                                             14

      14

      14

      14

      細(xì)胞產(chǎn)量                                         ~6.9

      ~6.0

      ~2.1

      ~0.9

      擴增倍數(shù)                                            230

      200

      70

      29.3

      CD3-/CD56+比例                             86.70%

      67.10%

      66.10%

      78.80%

      效應(yīng)NK細(xì)胞數(shù)量                            ~5.9

      ~4.0

      ~1.4

      ~0.7

      細(xì)胞毒性(E/T=5)                        100%

      75%

      72%

      68%

      培養(yǎng)基使用體積                               1.5L

      1.5L

      1.5L

      800 mL

      IL-2使用體積(1000IU/mL)             --

      1.5 mL

      1.5 mL

      --

      自體血漿使用體積                         9.5 mL

      22 mL

      3.5 mL

      3.6 mL

       

      參考文獻

      1.  Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500.

      2.  Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.

       

       

      北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司
      http://effectnews.cn
      400熱線:400-833-9299
      電話:010-82015225
      傳真:010-62015131
      聯(lián)系人:張鈺
      手機:13366202681
      QQ:1050524889

       

       

       

      購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 effectnews.cn

      所有試劑均用于科研 ???? 北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司 版權(quán)所有
      服務(wù)熱線:010-82015225/400-833-9299 | 傳真:010-62015131 | E-mail:info@bitebo.com
      京ICP備05028556號-1 ??京公網(wǎng)安備11010802008747??

      亚洲 日韩 欧美 成人 在线观看_思思久久96热在精品国产_亚洲中文无码mv_国产成本人片免费av_黄瓜视频在线观看
      • <mark id="rrqgw"></mark>

        <bdo id="rrqgw"><pre id="rrqgw"><strike id="rrqgw"></strike></pre></bdo>