引言
自然殺傷（NK）細(xì)胞在識(shí)別和殺死腫瘤和病毒感染的先天和后天免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵的角色。因此，已有許多研究嘗試研發(fā)在體外激活和擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，以用于和免疫細(xì)胞相關(guān)研究，而目前的方法包括使用細(xì)胞因子、化學(xué)試劑以及飼養(yǎng)細(xì)胞1， 其中細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性中具有核心作用。據(jù)報(bào)道， IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被歸類為NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增殖的活化細(xì)胞因子，并增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)各種腫瘤的細(xì)胞毒性作用2。然而，這些激活NK細(xì)胞的細(xì)胞因子組合仍需研究人員進(jìn)一步優(yōu)化。
此應(yīng)用說(shuō)明描述了使用康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II快速擴(kuò)增NK 細(xì)胞的步驟，以及能驗(yàn)證該試劑盒的測(cè)試方法。該測(cè)試結(jié)果顯示康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II能為研究人員制備擴(kuò)增能力強(qiáng)、細(xì)胞活力好以及細(xì)胞毒性高的NK細(xì)胞提供支持。
該NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II中含有1瓶1 mL的包被培養(yǎng)基，1瓶50 mL 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1瓶1,000 mL的擴(kuò)增培養(yǎng)基和1個(gè)透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋。前兩個(gè)試劑被專門(mén)設(shè)計(jì)用于NK細(xì)胞的激活培養(yǎng)，而擴(kuò)增培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)袋則被用于擴(kuò)增NK細(xì)胞。NK激活培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基均是采用優(yōu)質(zhì)的試劑和符合良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP）級(jí)的原料制造的。培養(yǎng)基中存在的唯一蛋白質(zhì)是可注射等級(jí)的血清白蛋白和重組人胰島素。
結(jié)果
NK細(xì)胞形態(tài)
樹(shù)突狀細(xì)胞附著在培養(yǎng)瓶表面上，而NK細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)會(huì)形成較小的細(xì)胞團(tuán)塊。該細(xì)胞團(tuán)塊的體積會(huì)隨著細(xì)胞密度的上升而增加。圖1顯示培養(yǎng)第10天后NK細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)。NK培養(yǎng)試劑盒和NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II的培養(yǎng)液中觀察到的細(xì)胞團(tuán)塊遠(yuǎn)多于競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y的培養(yǎng)基中觀察到的細(xì)胞團(tuán)塊。
材料和方法
根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用淋巴細(xì)胞分離液（康寧目錄編號(hào)：25-072-CI）將外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）從健康供體的血液中分離。
將3×107個(gè)細(xì)胞/mL的PBMC懸浮于20 mL的激活培養(yǎng)基（含10％自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基）中后轉(zhuǎn)移至預(yù)包被的T-75的培養(yǎng)瓶中， 隨后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)2-3天。T-75培養(yǎng)瓶在使用前均預(yù)先以NKCC-3培養(yǎng)基進(jìn)行包被。
將10 mL的激活培養(yǎng)基（含10％自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基）加入該T-75培養(yǎng)瓶中后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2天直至細(xì)胞密度達(dá)到2x106個(gè)細(xì)胞/mL以上。
懸液在800 ×g下離心5分鐘以收集所有PBMC細(xì)胞。將沉淀的細(xì)胞重新懸浮于含10%自體血漿的NKCC-2培養(yǎng)基中，再補(bǔ)充5%的自體血漿，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)。每2-3天檢查細(xì)胞狀態(tài)，并加入新鮮的NKCC-2培養(yǎng)基將細(xì)胞密度維持在5×105至1×106個(gè)細(xì)胞
/mL的范圍內(nèi)。培養(yǎng)14天后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)利用BD AccuriTM C6流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）分析細(xì)胞表面標(biāo)志物
（CD3-/CD56+）的表達(dá)。此外，該NK細(xì)胞還通過(guò)CCK-8法，以K562作為靶細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，即E/T的比率為5和10）檢測(cè)其細(xì)胞的毒性殺傷能力。
圖1. 培養(yǎng)10天后NK細(xì)胞的形態(tài)。培養(yǎng)于NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II、NK培養(yǎng)試劑盒、競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y10天后的NK細(xì)胞。以上為隨機(jī)選擇的照片。比例尺：200 µm。
NK細(xì)胞的增殖和擴(kuò)增
對(duì)于NK細(xì)胞的增殖，如圖2和圖3所示，NK細(xì)胞在分別利用NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II和NK培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)14天后擴(kuò)增了230倍和200倍，總細(xì)胞數(shù)量分別為7 x 109個(gè)細(xì)胞和 6 x 109個(gè)細(xì)胞，比競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I的培養(yǎng)試劑盒（只達(dá)到70倍的擴(kuò)增）多了3倍。利用競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y的培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)的NK細(xì)胞呈比較差的擴(kuò)增表現(xiàn)，這也與其細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。
NK細(xì)胞的表型
NK細(xì)胞的特異表面標(biāo)志物為CD3-/CD56+。流式細(xì)胞的分析結(jié)果 顯示使用NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II可獲得86.7％的NK陽(yáng)性細(xì)胞，而使用競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y的培養(yǎng)試劑盒則獲得相對(duì)較少的NK 陽(yáng)性細(xì)胞（分別為66.1％和78.8％），數(shù)據(jù)如圖4所示。
CCK-8細(xì)胞毒性
將5×105個(gè)及1×106個(gè)效應(yīng)細(xì)胞（NK細(xì)胞）/mL分別與1×105個(gè)靶 細(xì)胞（K562細(xì)胞）/mL在96孔微孔板（100 µL）中混合后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下隔夜共培養(yǎng)。分析前在每孔細(xì)胞均加入10 µL的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）試劑（Sigma目錄編號(hào)：96992） 并進(jìn)一步在37℃下孵育4小時(shí)后利用SpectraMax M4®（Molecular Devices）多功能微孔板檢測(cè)儀讀取吸光度數(shù)據(jù)。在E/T比例為5的狀況下，康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II與競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I（70％）和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y（60％）相比具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性（100％）。
圖5.CCK-8法評(píng)估NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該細(xì)胞毒性測(cè)定是在效應(yīng)細(xì)胞（NK細(xì)胞）與靶細(xì)胞（K562細(xì)胞）的比例為5和10的情況下進(jìn)行。
結(jié)論
 使用康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II可快速激活擴(kuò)增NK細(xì)胞，可獲取數(shù)量大（~70億細(xì)胞，即230倍的增殖），具有高細(xì)胞毒性效力（在E/T比例為5：1的狀況下達(dá)到100％的細(xì)胞毒性效力）的NK細(xì)胞。
康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II在無(wú)其他細(xì)胞因子（如IL-2）的條件下可以獲取較高的NK細(xì)胞增殖。
康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II具有一套完整的材料和詳細(xì)的操作程序。
與競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y的培養(yǎng)試劑盒相比，培養(yǎng)于康寧NK 無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II的NK細(xì)胞在生長(zhǎng)、NK陽(yáng)性細(xì)胞比率以及細(xì)胞毒性效力方面均表現(xiàn)出了更好的性能。
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附錄
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項(xiàng)目 NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II
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NK培養(yǎng)試劑盒
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競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品I
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競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品Y
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4個(gè)組分:
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5 個(gè)組分:
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1個(gè)組分:
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8個(gè)組分:
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1L NKCC-2擴(kuò)增培養(yǎng)基
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預(yù)包被的T75培養(yǎng)瓶
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NK培養(yǎng)基（2L/2瓶）
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NK培養(yǎng)基（2L/2瓶）
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50mL NKCC-1激活培養(yǎng)基
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1L的KBM NK擴(kuò)增培養(yǎng)基
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NK誘導(dǎo)因子（6瓶）
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1 mL NKCC-3包被培養(yǎng)基
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50 mL的NK基礎(chǔ)培養(yǎng)基
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項(xiàng)目 透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋
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1.8 mL的基礎(chǔ)添加試劑
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透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋
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產(chǎn)品包裝體積 1L
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1L
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1L
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2L
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PBMC的細(xì)胞接種數(shù)量 30 千萬(wàn)
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30 千萬(wàn)
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30 千萬(wàn)
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30 千萬(wàn)
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培養(yǎng)天數(shù) 14
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14
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14
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14
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細(xì)胞產(chǎn)量 ~6.9 億
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~6.0 億
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~2.1 億
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~0.9 億
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擴(kuò)增倍數(shù) 230
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200
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70
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29.3
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CD3-/CD56+比例 86.70%
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67.10%
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66.10%
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78.80%
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效應(yīng)NK細(xì)胞數(shù)量 ~5.9 億
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~4.0 億
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~1.4 億
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~0.7 億
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細(xì)胞毒性（E/T=5） 100%
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75%
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72%
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68%
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培養(yǎng)基使用體積 1.5L
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1.5L
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1.5L
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800 mL
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IL-2使用體積（1000IU/mL） --
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1.5 mL
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1.5 mL
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--
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自體血漿使用體積 9.5 mL
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22 mL
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3.5 mL
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3.6 mL
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參考文獻(xiàn)
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500.
2. Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
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