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LONZA內(nèi)毒素檢測－LAL 試劑 （點(diǎn)擊進(jìn)入）
動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑使用說明 概述：
鱟試驗(yàn)是一種最靈敏和專一的內(nèi)毒素檢查方法，它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物，通常稱為熱原。鱟試驗(yàn)的原理是內(nèi)毒素與LAL反應(yīng)可形成易于分辨的凝膠。簡單、經(jīng)濟(jì)的的鱟試驗(yàn)使得它已廣泛應(yīng)用于半成品、原材料以及藥品、醫(yī)療器械和生物制品等產(chǎn)品的檢查。美國藥典的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和美國FDA指南為有效驗(yàn)證鱟試驗(yàn)法代替兔熱原法提供了標(biāo)準(zhǔn)方法。
借助電腦和微孔平板儀或試管儀，可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)，可精確地檢測出已設(shè)定的濁度。設(shè)定濁度的反應(yīng)時(shí)間與檢品中的內(nèi)毒素的量成反比，因此未知檢品中的內(nèi)毒素水平是通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較來確定的。用動(dòng)態(tài)測量，λ是標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低點(diǎn)。
生物原理
Frederick Bang觀察到細(xì)菌導(dǎo)致美洲鱟血管內(nèi)的血液凝結(jié)。在協(xié)作研究中，Levin和Bang發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致凝結(jié)現(xiàn)象的因素存在于鱟的阿米巴細(xì)胞中或循環(huán)血液細(xì)胞中，熱原（細(xì)菌內(nèi)毒素）觸發(fā)濁度和凝膠形成酶促反應(yīng)。
美國FDA終產(chǎn)品檢測指南：
美國食品與藥品管理局在1987年發(fā)布了一份準(zhǔn)則，通知生產(chǎn)人用藥品和生物制品、獸用藥品和醫(yī)療器械的廠商，F(xiàn)DA認(rèn)為有必要用于驗(yàn)證鱟試驗(yàn)作為終產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢測方法的程序，那些遵照鱟試驗(yàn)準(zhǔn)則的廠商將被認(rèn)為符合CGMPs有關(guān)規(guī)定。非經(jīng)腸道藥品的通用內(nèi)毒素限值是5個(gè)內(nèi)毒素單位（EU）每公斤劑量，但鞘內(nèi)藥品的限值是0.2EU/Kg醫(yī)療器械浸取液不得超過0.5EU/ml；與腦脊髓接觸的器械的限值為0.06EU/ml。必須根據(jù)FDA的鱟試驗(yàn)指南（1987）的補(bǔ)充規(guī)定（1991）“臨時(shí)指導(dǎo)原則”進(jìn)行動(dòng)態(tài)濁度分析。
鱟試劑：凍干的濁度試劑含有用單價(jià)和二價(jià)陽離子加以穩(wěn)定的緩沖過的鱟阿米巴細(xì)胞溶解物。靈敏度，λ是參考美國標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-5標(biāo)定的，用EU/ml標(biāo)示。它是EU/ml表示的RSE的最低濃度并在標(biāo)準(zhǔn)條件下產(chǎn)生凝膠。
復(fù)溶：將試劑瓶在一堅(jiān)固的表面輕彈使瓶中的鱟試劑粉末落到瓶底。小心地移開蓋子釋放真空，避免接觸污染。殘留在膠塞上的少量試劑是無關(guān)緊要的。在使用前立即用5.2毫升的無熱原水復(fù)溶試劑，用移液棒將水直接加入瓶中，不立即使用時(shí)用無熱原封口膜蓋住瓶口，輕輕攪動(dòng)直到鱟試劑溶解于無色溶液中。如果封口破損或出現(xiàn)顏色或混濁則將它們丟棄。
貯存：凍干的鱟試劑在熱的條件下還是相對穩(wěn)定的，但還是應(yīng)存放在2-8℃下；避免長時(shí)間放置在高于25℃的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程中最好放在一冰冷的表面上或2-8℃的冰箱里存放24小時(shí)以內(nèi)，否則在復(fù)溶并凍結(jié)后將其存放在-20℃以下，可存放28天，鱟試劑只能凍融一次。
ACC可提供E.coli內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）用于復(fù)核試劑的靈敏度、驗(yàn)證產(chǎn)品檢測方法和制備抑制對照管（陽性水和陽性產(chǎn)品對照），參考每一批CSE的分析證明中關(guān)于效價(jià)、復(fù)溶和貯存的信息。該批產(chǎn)品必須另外訂購合適的CSE。
必須用LAL檢查用水（無LAL活性）復(fù)溶鱟試劑和制備樣品、對照管和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，該批產(chǎn)品必須另外訂購合適的LAL檢查用水。
警告和預(yù)防
警告：濁度法試劑只用于體內(nèi)診斷，使用時(shí)須小心因?yàn)槠涠拘匀圆粸槿怂?/font>
正確應(yīng)用該檢測方法要求嚴(yán)格遵守推薦程序中的所有項(xiàng)目，LAL原始記錄中必須包括陽性對照以檢測抑制條件。所有與樣品接觸的材料或檢測材料必須是無熱原的，玻璃器皿必須經(jīng)有效除熱原，（我們的經(jīng)驗(yàn)是標(biāo)示已滅菌和處理的塑料制品是無熱原的。那些不能經(jīng)高溫滅菌的材料或銷售時(shí)沒有無熱原標(biāo)簽的材料應(yīng)小心檢測其是否含內(nèi)毒素）。
樣品的采集和制備
所有與樣品或檢測試劑接觸的材料必須是無熱原的，在任何時(shí)候都要使用無菌技術(shù)。由于鱟試劑-內(nèi)毒素的反應(yīng)是與pH值有關(guān)的，樣品-鱟試劑的混合物應(yīng)產(chǎn)生6.5-8.0的pH值。如果需要調(diào)節(jié)pH值，使用無內(nèi)毒素TRIS緩沖液，不要隨便調(diào)節(jié)未緩沖溶液的pH值因?yàn)锳CC配方已經(jīng)緩沖過。
產(chǎn)品干擾
每一樣品的檢測方法必須經(jīng)過驗(yàn)證證明無明顯的干擾，抑制通常與濃度有關(guān)，可用LAL檢查用水稀釋來克服干擾。抑制的普遍來源包括1）干擾酶介反應(yīng)的和2）改變內(nèi)毒素（陽性）對照的分散性。
最大有效稀釋：美國食品和藥品管理局規(guī)定經(jīng)靜脈給藥的藥品的內(nèi)毒素限值為5EU/kg，鞘內(nèi)藥品為0.2EU/ml。但對于一些簡單的藥品也采用特殊限值，這些限值可以用來確定稀釋的范圍以克服干擾問題而不會(huì)超過限定的內(nèi)毒素濃度，最大有效稀釋（MVD）是按照以前提到的文件和其它藥典中提供的公式來計(jì)算的。
對于有公布限值的藥品，MVD可按下列公式計(jì)算：
MVD＝ 內(nèi)毒素限值×產(chǎn)品效價(jià)
靈敏度
例如，環(huán)磷酰胺的內(nèi)毒素限值是0.17EU/mg，如果使用最低內(nèi)毒素水平為0.05EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測效價(jià)為20 mg/ml的產(chǎn)品，MVD等于1:68,這樣, 環(huán)磷酰胺可最大稀釋到1:68以解決潛在的抑制(一份樣品比68份無熱原水)
用動(dòng)態(tài)法進(jìn)行干擾（抑制/增強(qiáng)）檢測試驗(yàn)是用已知濃度的內(nèi)毒素強(qiáng)化或稀釋樣品并根據(jù)供應(yīng)商的說明重復(fù)兩管檢測其峰值回收率，這個(gè)試驗(yàn)要求用RSE或CSE制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線（參閱CSE的分析化驗(yàn)證明），標(biāo)準(zhǔn)曲線至少應(yīng)包括三個(gè)RSE或CSE濃度，還應(yīng)包括另一標(biāo)準(zhǔn)品以分辨在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的每一個(gè)10倍稀釋的增長。曲線必須符合“試驗(yàn)特征”中所述的標(biāo)準(zhǔn)。
選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)做干擾檢測，例，范圍為5至0.05EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性產(chǎn)品對照濃度是0.5EU/ml。（見日常檢測）
強(qiáng)化的藥品的內(nèi)毒素含量均值，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，如果在±50%以內(nèi)則認(rèn)為無干擾，回收率不在
±50%以內(nèi)表明樣品受到干擾，用無熱原水繼續(xù)稀釋樣品直到獲得有效的回收率，但不能超過MVD。另一種檢測干擾的方法是4l內(nèi)毒素回收率在±50%以內(nèi)。
動(dòng)態(tài)濁度檢測程序
可在有以下功能的試管或微孔平板儀上用KTA2作動(dòng)態(tài)濁度分析：A）可測量相對于時(shí)間的光密度值的變化的檢測系統(tǒng)B）微電腦和相應(yīng)的軟件通過線性回歸分析信息。
每個(gè)試驗(yàn)應(yīng)包括樣品或稀釋的樣品或產(chǎn)品、陽性產(chǎn)品對照管，包含設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的一系列稀釋或陽性水對照管和一陰性對照管，至少重復(fù)兩管檢測，按照自動(dòng)內(nèi)毒素測量系統(tǒng)提供的指導(dǎo)進(jìn)行操作。
方法：無菌地將0.1ml的每個(gè)樣品移到微孔平板的每個(gè)孔底，在準(zhǔn)備鱟試劑的添加的同時(shí)將平板至少預(yù)熱10分鐘；否則遵照儀器供應(yīng)商的說明。然后用配量器快速將0.1ml的鱟試劑加入每個(gè)孔中，先加陰性對照，最后加最高的內(nèi)毒素濃度。如果平板儀不能自動(dòng)混合溶液，輕拍平板側(cè)面幾次并及時(shí)啟動(dòng)定時(shí)觀察，期望的監(jiān)控階段結(jié)束后，啟動(dòng)結(jié)果的分析程序。
要求的試劑/材料但不供應(yīng)：
微孔平板，可任意處理并已除熱原
玻璃稀釋試管，無熱原
獨(dú)立包裝的移液器，滅菌移液針頭
滅菌移液棒，獨(dú)立包裝，用無菌吸頭自動(dòng)吸取液體
旋渦混合器
平板儀或試管儀
日常檢查
用雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線作日常檢查是最有效的；每個(gè)檢查的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包括至少三個(gè)內(nèi)毒素濃度，重復(fù)兩管檢測，例如5，0.5和0.05EU/ml。對于半成品或原材料的檢測，從5至0.005 EU/ml的四個(gè)數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能更合適。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的一致性時(shí)，可制作存檔曲線，按《臨時(shí)鱟試驗(yàn)指南》中所述，使用三次檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；若使用存檔曲線，陽性水對照在該曲線上的固定值平均數(shù)誤差須在±25%范圍。
陽性產(chǎn)品對照（PPC）應(yīng)含有等于標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度，例如上面介紹的0.5EU/ml。參考臨時(shí)鱟試驗(yàn)指南來選擇PPC，PPC的內(nèi)毒素濃度平均值必須落在±50%的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，確證污染的測定時(shí)應(yīng)做內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品系列。ACC推薦的有效的強(qiáng)化技術(shù)是直接將內(nèi)毒素加入檢品中強(qiáng)化，用這一技術(shù)制備陽性產(chǎn)品對照的過程是在加入顯色試劑前將10μl的5.0 EU/ml的CSE加入到已含100μl檢品的微孔平板的孔中。
結(jié)果
內(nèi)毒素濃度的計(jì)算
在整個(gè)檢測過程中，試管儀或微孔平板儀監(jiān)測吸光度的增加，儀器記錄吸光度明顯增加所需的時(shí)間，通常是0.050至0.200 光密度單位，這一時(shí)間稱為反應(yīng)時(shí)間。儀器軟件自動(dòng)形成每一標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)時(shí)間與它相應(yīng)的內(nèi)毒素濃度的雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的特征并評估確定該分析是否有效。下面列示了一標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品產(chǎn)品中的0.5EU/ml內(nèi)毒素的回收率。
代表性線性分析
樣品 CSE（EU/ml） 平均反應(yīng)時(shí)間（秒） 回收率（EU/ml）
STD1 50.0 337
STD2 5.0 493
STD3 0.5 801
STD4 0.05 1400
STD5 0.005 3025
ACG.SPL1 --- **** <0.005
AVG.PPC 0.5 822 0.706(141%)
回歸等式：Log(y)=-0.236Log(x)+2.879
相關(guān)系數(shù)：g = -0.991
在這個(gè)例子中，每個(gè)樣品（SPL）的陽性對照（PPC）的內(nèi)毒素回收率表明無抑制。
陰性對照的內(nèi)毒素濃度應(yīng)明顯低于最低的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度。
如果相關(guān)系數(shù)的絕對值大于0.980，可用一多項(xiàng)回歸模式來描述標(biāo)準(zhǔn)曲線。多項(xiàng)回歸模式的計(jì)算是為使用WinKQCL、Biolise或此類軟件的用戶準(zhǔn)備的。請參考有關(guān)軟件手冊和以下描述多項(xiàng)式回歸模式的部分。
多項(xiàng)回歸模式
如果線性相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980，多項(xiàng)回歸模式適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。
注：多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線不能用于初次質(zhì)量檢測。根據(jù)管理?xiàng)l例，對于這種檢測FDA只接受線性回歸模式。
上面的例子用四個(gè)項(xiàng)（五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行分析，將得出以下結(jié)果：
多 項(xiàng) 分 析
樣品 CSE（EU/ml） 平均反應(yīng)時(shí)間（秒） 回收率（EU/ml）
STD1 50.0 337
STD2 5.0 493
STD3 0.5 801
STD4 0.05 1400
STD5 0.005 3025
AVG.SPL1 --- **** <0.005
AVG.PPC 0.5 122 0.445(89%)
匹配的回歸等式:
Log(y)=0.0031*Log(x)4+0.001*Log(x)3 +0.011*Log(x)2-0.216*Log(x)+2.837
線性相關(guān)系數(shù): g = -0.991
程序的局限性
如果不出現(xiàn)用可接受的稀釋（參考MVD計(jì)算）或樣品預(yù)處理，如緩沖，可消除的抑制或增強(qiáng)因素，樣品可用鱟試驗(yàn)方法檢測，如果鱟試驗(yàn)方法不能在最大有效稀釋的濃度內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，則不能用鱟試驗(yàn)代替美國藥典熱原檢測方法。
試驗(yàn)特征
斜率：在用于確定內(nèi)毒素水平的濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率必須經(jīng)過驗(yàn)證，至少應(yīng)檢測三個(gè)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)三管檢測。相關(guān)系數(shù)g應(yīng)大于或等于0.980的絕對值。
動(dòng)態(tài)濁度的質(zhì)量控制過程
遵照FDA鱟試驗(yàn)指南關(guān)于終產(chǎn)品檢測的凝膠法質(zhì)量控制過程包括增加理論濃度在±50%范圍內(nèi)的陽性產(chǎn)品對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線必須有一個(gè)≤-0.980的相關(guān)系數(shù)。
用ACC的濁度法試劑驗(yàn)證過的檢測方法不需要用KTA2重新驗(yàn)證。
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的一致性時(shí)，可制作存檔曲線，使用三次檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；若使用存檔曲線，陽性水對照在該曲線上的固定值平均數(shù)誤差須在±25%范圍。
期望值
濁度法鱟試劑是根據(jù)美國標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-5來標(biāo)定的,因此靈敏度用EU/ml來表示。如果濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)可對內(nèi)毒素進(jìn)行定量。生物來源的水或材料如果提純未完成，可能含有可測量水平的內(nèi)毒素。確定的內(nèi)毒素含量應(yīng)與內(nèi)毒素限值比較來評估其特征。
使用適當(dāng)?shù)臈l件，ACC的有效范圍從100-0.001 EU/ml。影響標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的選擇的因素包括 A） 分析儀器的參數(shù)，B）回歸模板的選擇，和C）分析試劑和實(shí)驗(yàn)室用具的質(zhì)量
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購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
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