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        生物知識(shí)

        ELISA試劑盒原理

        作者:admin 來源:本站 發(fā)布時(shí)間: 2011-03-07 17:52  瀏覽次數(shù):
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        ELISA

        ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

         

          () 原理

        ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中,通過不同的設(shè)計(jì),具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法(a)、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法(b)以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

         

          () 操作步驟

          方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

          1. 包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110μgml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4 過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌,下同)

          2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)

          3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml37 孵育0.51小時(shí),洗滌。

          4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml37 1030分鐘。

          5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml

          6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽性。

          方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法:

              用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110μgml,
              每孔加0.1ml4℃過夜。次日洗滌3次。

                      ↓

              加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
              中,37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照)

                      ↓

              于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,
              37℃孵育30-60分鐘,洗滌,最后一遍用DDW洗滌。

                      ↓

        其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、56。

         

          () 試劑器材

          1. 試劑

          (1) 包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):

              NaHCO   1.59

              NaHCO3  2.93

              加蒸餾水至1000ml

          (2) 洗滌緩沖液(PH7.4PBS)0.15M

              KH2PO4      0.2

              Na2HPO·12H2O  2.9

              NaCl       8.0

              KCl        0.2

              Tween-20 0.05% 0.5ml

              加蒸餾水至1000ml

          (3) 稀釋液:

               牛血清白蛋白(BSA) 0.1

               加洗滌緩沖液至100ml

            或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510%使用。

          (4) 終止液(2M HSO4):

          蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98)21.7ml。

          (5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

            0.2MNaHPO(28.4克/L)25.7ml

            0.1M檸檬酸(19.2克/L)      24.3ml

            加蒸餾水50ml

          (6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:

            TMB(10mg5ml無水乙醇)0.5ml

            底物緩沖液(PH5.5)    10ml

            0.75HO2    32μl

          (7) ABTS使用液:

            ABTS        0.5mg

            底物緩沖液(PH5.5)  1ml

            3HO2   2μl

          (8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

          (9) 正常人血清和陽性對(duì)照血清。

          2. 器材:

          (1) 聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔,ELISA檢測(cè)儀,50μl100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。

          (2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

        (3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。

         

          () 注意事項(xiàng)

          1. 正式試驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

          2. 在ELISA中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括:

          (1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

         ?。?/span>2 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH9.09.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 1824小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.11.010μgml)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為110μgml

          (3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

          (4) 酶的底物及供氫體的選擇:對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(OPD)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMBABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。

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