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購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 effectnews.cn |
ELISA ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。
(一) 原理 ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中,通過不同的設(shè)計(jì),具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法(圖a)、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
(二) 操作步驟 方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌,下同)。 2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。 3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時(shí),洗滌。 4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。 5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽性。 方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法: 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml, ↓ 加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔 ↓ 于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml, ↓ 其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
(三) 試劑器材 1. 試劑 (1) 包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液): NaHCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml (2) 洗滌緩沖液(PH7.4PBS):0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克 KCl 0.2克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸餾水至1000ml (3) 稀釋液: 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5~10%使用。 (4) 終止液(2M H2SO4): 蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。 (5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸): 0.2MNa2HPO4(28.4克/L)25.7ml 0.1M檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。 (6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液: TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml 底物緩沖液(PH5.5) 10ml 0.75%H2O2 32μl (7) ABTS使用液: ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3%H2O2 2μl (8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。 (9) 正常人血清和陽性對(duì)照血清。 2. 器材: (1) 聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔,ELISA檢測(cè)儀,50μl及100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。 (2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。 (3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。
(四) 注意事項(xiàng) 1. 正式試驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。 2. 在ELISA中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括: (1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。 ?。?/span>2) 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml。 (3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。 (4) 酶的底物及供氫體的選擇:對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。 |
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