blueski推薦 [2010-4-15]
出處：審評三部
作者：蔣煜
摘要：由于方法本身的優(yōu)越性，采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原法的國內(nèi)申報資料逐年增加，但部分資料仍存在一定缺陷，本文對該法及其影響因素、質(zhì)控要點等進行簡要評述，以期申請人注意規(guī)范對該部分的研究工作。
關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素 方法學(xué)
熱原檢查法或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是注射制劑的關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)之一。一直以來，熱原檢查在藥物研發(fā)中廣泛使用，方法比較成熟，目前藥典和其他國家標(biāo)準(zhǔn)中有很多品種采用熱原檢查，但熱原檢查易受試驗動物個體差異，方法靈敏度、藥物本身性質(zhì)（某些藥物如乳糖酸紅霉素引起降溫，青霉素往往也有類似作用，兩性霉素B 可引起升溫）等影響，使用受到一定限制；細(xì)菌內(nèi)毒素法系利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機理，檢測供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量的方法，由于方法靈敏度高、準(zhǔn)確、快速和經(jīng)濟等優(yōu)點，已在各國藥典中得到推廣。當(dāng)然也仍有部分藥物因為藥物干擾等其他因素?zé)o法使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。上述兩種方法目前都是可行的內(nèi)毒素物質(zhì)檢查方法，在實際應(yīng)用過程中可以結(jié)合藥物本身性質(zhì)進行選擇。但在審評中發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法國內(nèi)研究時間不長，導(dǎo)致部分注冊申請人在藥物研發(fā)時對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的認(rèn)識上存在一定偏差，本文希望通過對該方法的方法學(xué)和限值計算的相關(guān)介紹，使研發(fā)者增進對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的認(rèn)識，提高藥物研發(fā)水平。
關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素的研究方法，中國藥典2000年版納入的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法為凝膠法（附錄XI E），在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)用指導(dǎo)原則中（附錄XIX F）提出了濁度法和顯色基質(zhì)法。即將執(zhí)行的中國藥典2005年版將兩部分進行了合并，并進行了修訂，納入了凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法是測定凝膠形成過程中的濁度變化，可進一步細(xì)分為終點濁度法和動態(tài)濁度法，在做細(xì)菌內(nèi)毒素定量測定時，檢測波長一般為360nm。顯色基質(zhì)法是測定特殊底物釋放出來的生色團，也可分為終點顯色法和動態(tài)顯色法，定量測定的檢測波長一般為405nm或545nm。
影響細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果的因素較多，一般包括：試劑因素（鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品）；樣品因素（pH值、溫度、離子強度、濃度、可發(fā)生鱟試劑反應(yīng)的非內(nèi)毒素雜質(zhì)）和實驗因素（試驗器皿、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、鱟試劑的抗干擾能力）等等。中國藥典要求在實驗前必須對試驗器皿進行處理、復(fù)核鱟試劑靈敏度、考察供試品干擾試驗等，以排除上述干擾，避免假性試驗結(jié)果。上述試驗實際上是方法學(xué)驗證過程，以保證該方法的準(zhǔn)確性和可信性。
方法確定之后，就需要根據(jù)品種用法用量等具體情況測算細(xì)菌內(nèi)毒素限值。內(nèi)毒素限值指單位藥物（制劑）所含內(nèi)毒素的最大濃度，中國藥典2000年版和2005年版均采用公式L=K/M計算。其中K指注射途徑內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱閾劑量，或病人無任何不良反應(yīng)的內(nèi)毒素閾劑量，實際計算時為5EU/kg。M一般可以理解為每公斤體重1小時內(nèi)給予藥物的最大量（藥物用量或輸液體積）。對于靜脈滴注制劑，通常采用1小時內(nèi)輸注的劑量，對于皮下肌肉或靜脈注射，一般采用單次劑量計算。例如注射用頭孢哌酮鈉，其臨床單次使用最大量為2g，按60kg、每小時所折算的限度應(yīng)為0.15EU/mg。在實際操作過程中，根據(jù)慣例或者提高藥品質(zhì)量的要求，一般各國藥典均在上述計算最高限度基礎(chǔ)之上將限度要求提高2-3倍，如中國藥典2005年版注射用頭孢哌酮鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值即為0.05EU/mg。
以上是細(xì)菌內(nèi)毒素方法和限值計算的簡要介紹。由于GMP的實施、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的經(jīng)濟性、藥檢所檢查的方便性和準(zhǔn)確性等因素，目前采用該法的申報資料逐年上升，已逐漸取代了熱原檢查法的地位，這體現(xiàn)了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法本身的優(yōu)越性，但部分申報資料中也或多或少存在一定問題，如：僅僅按照中國藥典要求對該項進行檢查，忽視了對方法學(xué)的驗證，試驗結(jié)果可信度低；另外由于不同廠商生產(chǎn)的鱟試劑其生產(chǎn)工藝、配方、質(zhì)量參數(shù)等存在一定的差異，鱟試劑其抗干擾能力存在差別，但申請人忽視了對鱟試劑的選擇，或?qū)c試劑靈敏度的考察。在實驗過程中未考察供試液濃度、pH值的影響，未進行干擾性試驗等致使出現(xiàn)假陰性和假陽性試驗結(jié)果；部分申請人未結(jié)合藥物具體的臨床用量，設(shè)置的細(xì)菌內(nèi)毒素限值要求偏低，無法滿足安全性要求；穩(wěn)定性考察過程中，不注意選取安全性指標(biāo)如細(xì)菌內(nèi)毒素項目在最后時間點進行考察，不能對制劑的生物學(xué)穩(wěn)定性有充分的把握；等等。凡此種種，都一方面可能影響申報進度，另一方面也不利于對產(chǎn)品安全性的全面認(rèn)識，因此我們建議申請人在后續(xù)品種的研發(fā)和申報過程中，能夠不斷規(guī)范對細(xì)菌內(nèi)毒素的研究工作。
以上為個人觀點，希望與大家就此展開進行討論交流，共同提高對細(xì)菌內(nèi)毒素研究工作的認(rèn)識。
參考文獻
(1) 中國藥學(xué)雜志1997年2月第32卷第2期
(2) 中國藥事2000年第14卷第2期
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