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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 effectnews.cn |
ALEXIS 現(xiàn)貨 http://effectnews.cn/a/gb2312/product/qt/2010/0913/3627.html
小鼠內(nèi)毒素中毒性休克模型及其救治藥物 的藥效比較
近幾十年來，對內(nèi)毒素休克的研究很多，但一直沒有滿意的治療方法，死亡率仍高達(dá)65～80%。本實(shí)驗(yàn)以探討內(nèi)毒素休克的發(fā)生機(jī)制及比較一些藥物治療為目的。 一 實(shí)驗(yàn)方法 １．粗制內(nèi)毒素；復(fù)制小鼠內(nèi)毒素中毒性休克模型；測定小鼠內(nèi)毒素中毒的LD50和LD99。 ２．比較一些抗內(nèi)毒素中毒性休克的藥物阿托品、地塞米松、復(fù)方丹參注射液、地塞米松＋復(fù)方丹參注射液合并用藥的中西醫(yī)結(jié)合療法對模型小鼠休克的療效。 二 試劑 阿托品(鄭州市新鄭制藥廠，批號980301)，地塞米松（廣州市橋制藥廠，批號981209），復(fù)方丹參注射液（河南省信陽大別山制藥廠，批號9810081），生理鹽水，營養(yǎng)瓊脂（上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠，批號970403），大腸桿菌K12W1485。 三 器械 注射器（１ml），針頭（4號），小鼠罩，天平及砝碼，小燒杯，滴定管，721型分光光度計(jì)（50HZ，220V，上海第三分析儀器廠制造），JY 92-2型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。 四 實(shí)驗(yàn)對象 昆明小白鼠（120只） 五 實(shí)驗(yàn)方法 ５．１粗制內(nèi)毒素[9] 參考文獻(xiàn)[9]的方法加以改進(jìn)： ５．１．１ McFarland氏標(biāo)準(zhǔn)管的配制：1%BaCl
2 0.3ml+1%H2SO4 9.7ml制成9億個(gè)/ml細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)管。 600W），得實(shí)驗(yàn)用粗制的內(nèi)毒素。 23克），雌雄各半，不同性別小鼠按體重隨機(jī)分成6組（第六組為對照組，注射生理鹽水）。每組動物稱重并標(biāo)記后分別按設(shè)計(jì)濃度及容積腹腔注射內(nèi)毒素。記錄給藥時(shí)間。 25kg），雌雄各半，隨機(jī)平均分為5組，各動物稱重并標(biāo)記。各組動物分別注射內(nèi)毒素的LD99劑量。觀察注射后小鼠的反應(yīng)。
觀察時(shí)間 死亡小鼠數(shù)目 一組 二組 三組 四組 五組 六組 1 9：15pm 1 0 0 0 0 0 2 11：52pm 0 1 1 0 0 0 3 次日1：00am 0 1 1 0 0 0 4 6：30am 0 1 2 6 5 0 5 7：30am 1 0 0 1 0 0 6 9：00am 0 0 1 0 0 0 7 9：40am 1 0 0 1 0 0 8 12：25pm 0 1 2 0 2 0 9 2：43pm 0 0 1 2 0 0 10 9：24pm 1 1 1 0 2 0 11 次日7：31am 0 2 0 0 0 0 總計(jì) 共觀察48小時(shí) 4 7 9 10 10 0 藥物 24小時(shí)后剩余數(shù)目（只） 72小時(shí)后剩余數(shù)目（只） 1 阿托品 3 2 2 地塞米松 6 2 3 復(fù)方丹參注射液 1 1 4 地塞米松+復(fù)方丹參注射液 3 0 5 生理鹽水 0 0 內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞璧中的脂多糖（LPS）組分，只有當(dāng)細(xì)菌死亡破裂或用人工方法裂解菌體后才釋放。不同革蘭陰性菌感染時(shí)，由內(nèi)毒素引起的毒性作用大致相似，本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌K12W1485制取的內(nèi)毒素。當(dāng)血液中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌釋放大量內(nèi)毒素入血時(shí)[1]，可導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，嚴(yán)重時(shí)則形成以微循環(huán)衰竭和低血壓為特征的內(nèi)毒素休克，死亡率極高。其病理生理特征主要為低血壓，血管收縮反應(yīng)性降低，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和多器官功能衰竭。其作用機(jī)制為：（1）內(nèi)毒素引起交感──腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，使NE、5-HT增多，致小血管收縮痙攣，微循環(huán)障礙。（2）影響線粒體代謝，使自由基產(chǎn)生增多，致細(xì)胞膜損傷。（3）激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等活性，引起TNF、IL-1，IL-6等細(xì)胞因子的釋放，IL-1和TNF協(xié)同誘導(dǎo)血管舒張和白細(xì)胞介導(dǎo)的組織壞死，造成器官衰竭和死亡。誘導(dǎo)誘導(dǎo)型NO合成酶的表達(dá)，使NO增多。NO既有促炎作用，又能抑制磷酸烯酸丙酮酸生成，尤其是NO 將小鼠注入內(nèi)毒素的LD99劑量，倘若不進(jìn)行搶救則小鼠會14小時(shí)內(nèi)全部死亡。而本實(shí)驗(yàn)在注入內(nèi)毒素LD99劑量后半小時(shí)內(nèi)分別注入阿托品、地塞米松、復(fù)方丹參注射液、地塞米松+復(fù)方丹參注射液四種搶救藥物及生理鹽水。注射了搶救藥的四組小鼠的存活時(shí)間及存活率均明顯高于生理鹽水對照組。其中，注射了阿托品和地塞米松的兩組的存活率相對最高，達(dá)25%；注射了復(fù)方丹參注射液的一組的存活率為12.5%；而注射地塞米松+復(fù)方丹參注射液和生理鹽水的兩組小鼠全部死亡。從上述結(jié)果可以看出，在本實(shí)驗(yàn)中選用的幾種搶救藥物均能在不同程度上緩解內(nèi)毒素的中毒癥狀和提高存活率。 阿托品組的小鼠在注射藥物后中毒癥狀在10分鐘內(nèi)逐漸得到緩解且存活率相對較高，可能是由于阿托品能被機(jī)體迅速吸收，因?yàn)榘⑼衅纺苤苯优c細(xì)胞膜上的受體作用，所以對機(jī)體的作用較快，在短時(shí)間內(nèi)就能緩解中毒癥狀。但24小時(shí)存活率為37.5%，存活時(shí)間不及地塞米松，可見其藥效不及地塞米松持久，要加強(qiáng)藥效可能應(yīng)在相隔一段時(shí)間后再注射，如此反復(fù)幾次。阿托品[3][6]是乙酰膽堿等受體的阻斷劑，對抗其擴(kuò)血管作用，使毛細(xì)血管前括約肌收縮關(guān)閉，因此回心血量增加，血壓回升。大劑量使用其治療中毒性休克，可解除血管痙攣，改善微循環(huán)。 地塞米松組的小鼠在注射藥物后中毒癥狀的緩解不如阿托品組的明顯，存活率與阿托品組相同?？赡苁怯捎诘厝姿梢ㄟ^細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與胞漿受體結(jié)合，再由胞漿轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，與核受體結(jié)合形成激素 復(fù)方丹參注射液組在注射藥物后的癥狀緩解及存活率均不如上述兩組，但存活時(shí)間仍大于14小時(shí)?？赡苡捎诘橹兴幹苿?，藥效因而比較緩慢且較弱。丹參[2]有活血化淤、改善微循環(huán)和抗凝的作用，可明顯升穩(wěn)血壓、減慢心率、增加尿量。其抗內(nèi)毒素中毒性休克的機(jī)理可能是拮抗LPS；對抗氧自由機(jī)對細(xì)胞的損害；改善血液流變學(xué)異常，抗DIC（彌漫性血管內(nèi)凝血），從而改善微循環(huán)；保護(hù)內(nèi)臟細(xì)胞及亞細(xì)胞膜，從而拮抗MOF；改善肝細(xì)胞線粒體能量代謝，減輕酸中毒。 地塞米松與復(fù)方丹參注射液合用組[5]在注射藥物后中毒癥狀有所緩解，效果與地塞米松組相當(dāng)；24小時(shí)存活率為37.5%，與阿托品組相同；但48小時(shí)后全部死亡，這個(gè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果及參考文獻(xiàn)所述不一致。其原因可能是藥物的劑量不足，搶救不夠及時(shí)，以及各種環(huán)境因素所造成，具體原因不明。此種中西醫(yī)結(jié)合治療內(nèi)毒素中毒性休克的方法還有待進(jìn)一步研究。 本次實(shí)驗(yàn)中的四組搶救組的小鼠存活率均不高，其原因可能是所注射藥物劑量不足，搶救不夠及時(shí)，腹腔注射的藥物吸收慢且少。最主要的可能是小鼠內(nèi)毒素中毒后嗜睡，厭食，不喝水，以致饑餓缺水而死。 八 結(jié)論: 小鼠注射內(nèi)毒素后會出現(xiàn)一系列中毒癥狀，甚至休克、死亡。內(nèi)毒素中毒性休克的搶救藥物的藥效強(qiáng)弱為阿托品>地塞米松>復(fù)方丹參注射液>地塞米松+復(fù)方丹參注射液。阿托品為藥效快的短效藥物，藥效持續(xù)時(shí)間短；地塞米松為藥效緩慢的長效藥物，藥效持續(xù)時(shí)間長；復(fù)方丹參注射液的藥效緩慢且藥效相對較弱。 1:標(biāo) 題：內(nèi)毒素導(dǎo)致休克的作用機(jī)制探討4 著 者：段文卓; 宮海民 出 處：中國病理生理雜志 1997.04.15; 13(2): 220 2:標(biāo) 題：復(fù)方丹參注射液對兔內(nèi)毒素休克的防治作用 著 者：黃青青; 楊鏞; 萬林駿; 蘇美仙; 文士銘 出 處：中國危重病急救醫(yī)學(xué) 1998.04.10; 10(4): 227-230 3:標(biāo) 題：阿托品解痙作用的實(shí)驗(yàn)和抗感染性休克作用的探討 著 者：劉樹華 出 處：論文選編·建院三十周年專輯 1981.10; : 130-134 4:標(biāo) 題：腎上腺皮質(zhì)激素在感染性休克治療中的應(yīng)用 著 者：湯錫龍 出 處：安慶醫(yī)學(xué) 1990; (4): 21-22 5:標(biāo) 題：參附柴液與地塞米松對犬感染性休克合并DIC療效比較 著 者：劉玉英 6: 著 出 7:著 出 8:著 出 9:著 出處：中西醫(yī)結(jié)合雜志 1990; (11): 675-676標(biāo) 題：關(guān)于感染性休克病機(jī)理的探討:兼述阿托品抗感染性休克的藥理作用 者：黃學(xué)博 處：山東醫(yī)藥 1989; (11): 54標(biāo) 題：消炎痛在感染性休克中的作用:動物實(shí)驗(yàn)和臨床初步觀察 者：鄧杏飛 處：中華醫(yī)學(xué)雜志 1988; (8): 440-443標(biāo) 題：單用大劑量皮質(zhì)類固醇或與其它藥合用對膿毒性休克存活率的影響 者：王濤 處：戰(zhàn)傷參考資料 1986; (2): 34-35：標(biāo) 題：白藜蘆醇甘對大鼠內(nèi)毒素休克的影響 者：張曼 金麗娟 金春華 處：中國病理生理雜志 1997，13（3）：245
５．１．２營養(yǎng)瓊脂按4g/100ml蒸餾水混勻，置于燒瓶中，放置20分鐘，加熱溶化，分裝入高壓容器中高壓滅菌（101Kpa）15分鐘，無菌狀態(tài)下注入玻璃平皿中，冷卻，制成平板。將斜面低溫保存的K12W1485大腸桿菌接種到平皿上，劃勻，于37度恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。用生理鹽水沖洗生長的細(xì)菌，制成細(xì)菌懸液。用濃度標(biāo)準(zhǔn)比濁和721型分光度計(jì)測光密度值，雙重檢測細(xì)菌濃度，測定結(jié)果為100億個(gè)菌/毫升。將懸液于沸水煮沸15分鐘，反復(fù)凍融3次。經(jīng)初試效果稍差，進(jìn)一步改用超聲粉碎機(jī)粉碎細(xì)菌（500HZ，T：5min，工作時(shí)間：90s，間隙時(shí)間：5s，總定時(shí)次數(shù)：18次，W：500 ５．２測定內(nèi)毒素的LD50及LD99 ５．２．１預(yù)試：取12只小鼠（14 至26克，雌雄各半），不同性別小鼠按體重隨機(jī)分為三個(gè)劑量組，劑量比為1：3：9。每組分別給藥3.3ml/kg,10ml/kg,30ml/kg。給藥后觀察小鼠出現(xiàn)扭體反射(與死亡正相關(guān))的情況，觀察時(shí)間為3小時(shí)。 預(yù)試結(jié)果：3.3ml/kg組4只都沒出現(xiàn)扭體反射，10ml/kg組4只都沒出現(xiàn)扭體反射，30ml/kg組4只都出現(xiàn)扭體反射，即預(yù)試的小鼠全死劑量（Dmax）為30ml/kg，全不死劑量（Dmin）為10ml/kg。
５．３正式實(shí)驗(yàn)：
５．３．１計(jì)算各組劑量 根據(jù)預(yù)試測出的小鼠全死劑量（Dmax）全不死劑量(Dmin)范圍安排5組劑量。設(shè)n為組數(shù)，r為公比，根據(jù)r=（Dn/Dm）^（n-1）計(jì)算各組劑量。取n=5，則r=0.76，各組劑量為30ml/kg、22.8ml/kg、17.3ml/kg、13.1ml/kg、10ml/kg（每毫升細(xì)菌數(shù)：100億個(gè)）。 ５．３．２：配制藥液 ５．３．３：分組及給藥 取小鼠60只（18 ５．３．４：觀察與記錄 記錄觀察時(shí)間內(nèi)動物癥狀，中毒癥狀，及出現(xiàn)時(shí)間，死亡表現(xiàn)及死亡時(shí)間，計(jì)算各組死亡率。 ５．４參數(shù)的計(jì)算 用Bliss法電子計(jì)算機(jī)運(yùn)算小鼠內(nèi)毒素的LD50、LD99。 ５．５復(fù)制小鼠內(nèi)毒素中毒性休克模型 取小鼠40只（體重15 ５．６救治內(nèi)毒素中毒性休克藥物的藥效比較。 待上述六組小鼠出現(xiàn)中毒癥狀后，馬上分別注射藥物（腹腔注射）。每組注射藥物如下： 第一組：阿托品（濃度0.5mg/ml，注入0.08 ml/g，分三次完成，每次間隔一小時(shí)）；第二組：地塞米松（濃度0.35 mg/ml，注入0.02ml/g）；第三組：復(fù)方丹參注射液（濃度1.5 mg/ml，注入0.6ml/只）；第四組：地塞米松+丹參注射液（濃度同上,注入0.2ml+0.4ml,一小時(shí)后再注入地塞米松0.2ml）；第五組：（對照組）生理鹽水（0.6ml/只）。 觀察記錄注射藥物后動物的存活數(shù)，計(jì)算存活率，比較各種藥物的藥效。
六 結(jié)果:
作者: 黃慧梅 蘇潔明 趙婭敏 馬滾韶 指導(dǎo)老師:林老師(實(shí)驗(yàn)生理科學(xué)) 吳志均(微生物) 諸輝(分子醫(yī)學(xué)中心) 摘要 關(guān)鍵詞 ６．１:內(nèi)毒素(LPS)的LD50及LD99 小鼠打入內(nèi)毒素半小時(shí)后出現(xiàn)明顯的扭體反射及收腹效應(yīng)，一至五組出現(xiàn)的數(shù)目分別為2、5、6、8、9只。小鼠煩躁不安，氣喘，呼吸困難，呼吸加快，排便增多，繼之出現(xiàn)活動明顯減少，嗜睡，擠成一團(tuán)。口唇無明顯紫紺。 觀察兩天，小鼠死亡時(shí)間及數(shù)目見表一。小鼠死亡前翻正反射消失，口唇明顯紫紺，呼吸26次/min──34次/min且逐漸減少，腹瀉，肌張力明顯降低，角膜反射（+），痛覺反射（+）。死亡癥狀為先肌張力降低，抽搐，打顫，然后死亡。 表一：小鼠死亡時(shí)間及死亡數(shù)目（每組原有小鼠10只）
各組劑量分別為：10ml/kg, 13.1ml/kg, 17.3ml/kg, 22.8ml/kg, 30ml/kg 第四、五組的高濃度組小鼠死亡集中在注射內(nèi)毒素后8至14小時(shí),低濃度組死亡的時(shí)間分散在不同時(shí)間段。死亡數(shù)按給藥濃度從高到低為10、10、9、7、4，基本符合預(yù)期結(jié)果。自然死亡率為0。內(nèi)毒素LD50的具體計(jì)算見表二。 LD50= 9.9ml/kg LD95= 23.9ml/kg LD99= 34.4ml/kg ６．２:藥效比較 小鼠注射內(nèi)毒素后的癥狀與測定LD50時(shí)的癥狀相同。注射搶救藥物后，與生理鹽水對照組比，中毒癥狀有明顯緩解，活動能力稍強(qiáng)，且比沒搶救前強(qiáng)，呼吸稍平穩(wěn)，扭體反射及收腹效應(yīng)消失。但與中毒前相比，不如中毒前活潑，縮成一團(tuán)，嗜睡。注射了搶救藥物的小鼠的存活時(shí)間明顯長于注射生理鹽水的對照組。生理鹽水對照組小鼠的存活時(shí)間為8至14小時(shí)，無中毒減輕；搶救組的存活時(shí)間為24至72小時(shí)及72小時(shí)以上。死亡小鼠的癥狀與測定LD50時(shí)的相同。具體注射搶救藥物后的小鼠存活時(shí)間及存活數(shù)目見表三。 表三：注射搶救藥物后小鼠的存活時(shí)間及存活數(shù)目 實(shí)驗(yàn)動物:小白鼠 給藥方式:腹腔注射 劑量組數(shù):5 每組原有小鼠8只
七 討論: 前 言 |
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