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        生物知識

        pcr技術應用論文:熒光定量PCR技術在腫瘤研究中的應用

        作者:admin 來源:本站 發(fā)布時間: 2011-01-05 11:11  瀏覽次數(shù):
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        陳文學 鄒學森 陳岳青 黃秀珍 鐘禮瀑

        (江西省腫瘤醫(yī)院 腫瘤研究所, 江西 南昌 330029)

        [摘要] 熒光定量PCR技術具有簡便、靈敏、準確等優(yōu)點,目前已經在乙肝和性病的診斷和治療中得到了廣泛的應用,但在腫瘤方面的應用還處在研究和開發(fā)階段。本文綜述近年國內外相關熒光定量PCR技術在腫瘤研究中的應用。

        [關鍵詞] FQ-PCR;腫瘤;人乳頭瘤病毒;EB病毒



        腫瘤是危害人類健康的一種疾病,它的惡性程度與預后判斷主要依靠是否有轉移和病理切片分期。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展,腫瘤研究領域的大量研究成果顯示,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和預后與腫瘤細胞內部基因和腫瘤相關病毒有關。本文綜述了熒光定量PCR技術的原理及其在腫瘤研究中的應用。



        1.單管熒光定量PCR技術的原理

        單管熒光定量PCR(fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR)的反應體系中除了普通PCR所需的引物外,還有一條熒光探針,探針的5`端標記了熒光報告基團,3`端標記了熒光淬滅基團,當這條探針保持完整時,熒光淬滅基團抑制熒光報告基團發(fā)出熒光。PCR反應開始后,隨著DNA鏈的延伸,Taq酶的5`-3`外切酶活性將熒光探針切斷,熒光淬滅基團的作用消失,熒光報告基團就發(fā)出了熒光信號,熒光信號的強弱與PCR的產物數(shù)量成正比,根據(jù)測量到的熒光信號強弱,通過分析軟件得到樣本的原始拷貝數(shù)。



        2. FQ—PCR的優(yōu)點

        FQ—PCR技術是融合了PCR技術與DNA探針雜交技術的優(yōu)點,實驗的整個過程只在加樣時打開1次反應管,在PCR的每個循環(huán)中可以直接監(jiān)測到熒光信號的變化,根據(jù)PCR反應酶動力學特點分析軟件會自動對DNA進行定量,因此也有人稱FQ-PCR為實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)。其優(yōu)點為:①FQ-PCR解決了傳統(tǒng)PCR技術不能定量和擴增產物污染的問題。②避免了普通定量PCR操作過程中的污染,F(xiàn)Q-PCR只在加樣時打開反應管1次。③FQ-PCR操作簡便、快捷、結果準確,不需要普通PCR擴增后進行電泳或放射自顯影觀察結果,方便了臨床上應用。④FQ-PCR可以對每一批擴增樣本進行擴增效率的評價。對DNA做系列稀釋,每個稀釋濃度的DNA對數(shù)值與其Ct值做回歸分析,PCR的擴增效率的計算方法為:效率=10-1/斜率。通過計算擴增效率可以對儀器、操作人員和試劑進行綜合評定。



        3. FQ-PCR在血液系統(tǒng)腫瘤中的應用

        Jones CD(1)對FQ-PCR技術預測慢性髓性白血?。–ML)病人的髓外增的有效性進行了評價。FQ-PCR方法檢測372例臨床標本和50例外周血標本p210和 p190 bcr-abl RNA 融合基因的轉錄水平,用看家基因對結果進行標準化,檢測結果為特異性100%。敏感性研究顯示,細胞系稀釋到0.0001%時仍然可以檢測到bcr-abl,重復性實驗顯示組間變異系數(shù)(CV)為12.3%,組內變異系數(shù)為13.8。實驗結果顯示FQ-PCR是一種非常可靠的監(jiān)測bcr/abl陽性CML病人的方法。

        熒光原位雜交(FISH)的結果顯示10%-15%的CML病人bcr-abl雜合子缺失,這樣的病人預后非常差。FQ-PCR方法可以鑒定CML病人雜合子亞單位上的微小缺失,這種微小的缺失難于用FISH方法分辨出來。Kolomietz(2)用FQ-PCR方法對25例預后差的病人進行檢測,18例無微小缺失CML病人獲相對較好的治療效果。

        Hughes等(3)將1106例CML病人隨機分為imatinib(蛋白激酶抑制劑)治療組和INF-a+卡鉑治療組,用FQ-PCR檢測2個治療組病人血液中bcr-abl的轉錄水平,結果顯示imatinib治療組12個月后bcr-abl的轉錄水平降低了3個數(shù)量級,治療效果明顯優(yōu)于INF-a+卡鉑治療組。CML病人bcr/abl的轉錄水平降低了3個數(shù)量級或無轉錄者,預后較好。



        4. FQ-PCR在乳腺癌中的應用

        Weigelt等(4)用FQ-PCR方法檢測94例乳腺癌轉移的病人外周血CK19、p1B、PS2 和 EGP2的mRNA水平,通過QDA將4個基因綜合成一個評價指標。在77例乳腺癌骨轉移的病例中發(fā)現(xiàn)QDA陰性病人的存活率明顯高于QDA陽性病人(P=0.015 、0.0053),QDA陽性的病人1年存活率為3%,2年的總存活率為17%,而QDA陰性的病人存活率為36%。

        ANG1 和ANG2是腫瘤細胞分泌的促進腫瘤細胞生長和轉移的因子,Sfiligoi(5)研究了ANG與腫瘤細胞淋巴結轉移和腫瘤病人的生存率之間的關系。38例乳腺癌活檢標本提取mRNA,用FQ-PCR技術測定ANG1 和ANG2基因水平,檢測結果與臨床病理和臨床生化指標相比較,發(fā)現(xiàn)ANG2與腋窩淋巴結轉移有高度的相關性,單變量和多變量生存分析顯示,ANG2 mRNA 水平與疾?。╬ < 0.0001)、總存活率(p < 0.0003)呈單因素高度相關性。



        5. FQ-PCR在胃腸道腫瘤中的應用

        胃癌手術后的腹膜播散是胃癌復發(fā)的常見原因。Ueno(6)對124例胃癌手術病人實施腹腔灌洗,F(xiàn)Q-PCR技術檢測灌洗液中CEA水平,結果顯示CEA的Ct值與腫瘤的侵犯深度、淋巴結的轉移、血管轉移、腫瘤分期、存活率有高度的相關性。CEA的Ct值預測腫瘤腹膜轉移的敏感性為76.9%,特異性為67.7%,而細胞學檢測的敏感性只有23.1%。這些實驗數(shù)據(jù)顯示,F(xiàn)Q-PCR技術檢測灌洗液中CEA水平,對預后和診斷是否有腹膜轉移是一個很好的指標。

        alpha4GnT是一種糖苷轉移酶,它只存在于胃癌細胞中,外周血中檢測不到。Shimizu(7)對37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA進行熒光定量檢測,胃癌病人的檢出率為62.2%,而健康人未檢測出陽性。令人振奮的是有5例早期胃癌病人,胃癌侵犯只局限在粘膜層,alpha4GnT的mRNA的檢出率達到80%。慢性胃炎、胃幽門螺桿菌感染的良性病變的alpha4GnT mRNA水平明顯低于胃癌病人。這些結果表明定量檢測外周血中alpha4GnT的mRNA是對胃癌的一個很好的檢測指標。

        肝癌的早期發(fā)現(xiàn)對肝癌的治療和預后非常重要,Chuma(8)對7個早期肝癌結節(jié)和7個進展期肝癌結節(jié)的12 600個基因進行了定量分析,發(fā)現(xiàn)95個基因可以區(qū)分早期肝癌和正常組織,92個基因可以區(qū)分早期肝癌和進展期肝癌,其中熱休克蛋白70基因(HSP70)在早期肝癌結節(jié)中明顯上調,與癌前病變組織、正常組織存在明顯差異(p<0.001)。



        6. FQ-PCR在其它腫瘤中的應用

        Gelmini(9)用FQ-PCR方法檢測43例前列腺癌和16例前列腺良性增生病人的活檢組織PSA,前列腺癌病人的PSA mRNA水平變異非常大,平均2.5 x 107( 2 x 104 - 2.1 x 108 )/ml,而良性增生腫瘤組織的平均拷貝數(shù)為1.3 x 106/ml,前者的表達水平明顯高于后者(p = 0.006),但是前列腺癌組織的PSA mRNA水平與外周血中PSA mRNA水平無相關性。Straub(10)用高靈敏度的FQ-PCR方法檢測了129例前列腺癌根治術前后和19例前列腺良性增生的血標本中PSA mRNA水平,發(fā)現(xiàn)血漿中的PSA mRNA水平可以反映外周血中前列腺癌細胞的數(shù)量,對病人早期治療和手術后病情監(jiān)測及預后有一定幫助。

        Survivin 是一種凋亡抑制蛋白,在非小細胞肺癌(NSCLC)早期呈現(xiàn)過度表達。Falleni[11]對86例NSCLC病人(IA and IB)定量檢測Survivin mRNA水平,結果80例(96%)病人檢測出Survivin mRNA表達,明顯高于正常肺組織 (p = 0.008),并且鱗狀細胞癌的表達水平高于其它類型腫瘤(p = 0.0022),F(xiàn)Q-PCR技術是對肺癌早期診斷的一種有效手段。

        最近又有文獻報道將FQ-PCR技術應用到頭頸腫瘤(12)、口腔腫瘤(13)、淋巴瘤[14]等腫瘤中,得到了較好的檢測結果。



        7. 腫瘤相關病毒的檢測

        人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌的主要誘發(fā)因素,已經證實宮頸癌組織與正常組織的HPV早期基因(E7)的表達水平有顯著差異,Lamarcq等(15)用FQ-PCR方法探討宮頸脫落細胞E7基因的轉錄水平是否可以診斷早期宮頸癌,結果顯示在高分化SIL中HPV16或HPV18的E7基因的檢出率為47%,正常組織未檢測到,兩者存在顯著差異(p<0.006),此項實驗也證明E7基因可以作為宮頸癌早期篩查的指標。Dong SM等[16]對175例宮頸浸潤癌,57例宮頸原位癌,60例正常對照的血漿進行傳統(tǒng)PCR方法與FQ-PCR方法擴增HPV基因進行比較,傳統(tǒng)方法浸潤性宮頸癌的檢出率為6.9%, 原位癌的檢出率為 1.8%, 正常組織的檢出率為1.7% ,F(xiàn)Q-PCR方法對浸潤性宮頸癌的平均拷貝數(shù)為11163拷貝/ml,原位癌的拷貝數(shù)為8拷貝/ml,正常組織拷貝數(shù)為0,F(xiàn)Q-PCR方法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)PCR方法。

        早期鼻咽癌可以通過放射治療進行根治,中晚期鼻咽癌有較高的復發(fā)率。Dong(17)對170例沒有轉移的鼻咽癌實施統(tǒng)一的放射治療方案,在治療前和治療后6-8周用FQ-PCR方法檢測血漿中EB病毒的含量,治療后EB病毒的含量與鼻咽癌的總存活率有高度相關性(p<0.001),對鼻咽癌復發(fā)的陽性和陰性預測值分別為87%和83%。鼻咽癌治療后EB病毒的含量可以準確反映治療后腫瘤的殘余水平,與腫瘤病人的存活率有高度相關性。



        8. 腫瘤多藥耐藥基因檢測

        腫瘤的多藥耐藥基因的出現(xiàn)使許多腫瘤患者治療失敗,以往用流式細胞儀或者免疫組化的方法檢測p糖蛋白(多藥耐藥蛋白)是否表達,或者用PCR的方法檢測mRNA,這些方法都很難實現(xiàn)標準化的操作和統(tǒng)一判斷標準。FQ-PCR方法可以實現(xiàn)標準化的操作,并且可以直接定量出多藥耐藥基因(MDR)的拷貝數(shù)。Burger等(18)對59例原發(fā)性乳腺癌,以化療為系統(tǒng)治療的病人,進行了BCRP、LRP、MRP1、MRP2和MDR1基因的mRNA定量測定,結果為對化療中度反應的病人5種基因的mRNA水平明顯低于對化療沒有反應的病人。其中MDR1基因高表達組的病例分期明顯低于MDR1基因低表達組(p<0.005),而且預后差。其它4種基因也存在同樣差異,但是沒有明顯的相關性。Tseng(19)對50對正常與頭頸癌組織的MDR1 mRAN研究中發(fā)現(xiàn),27例T/N>1的標本中IV、III、II和 I期的MDR1分布為59.3%、22.2%、14.8%和3.7%,MDR1水平與腫瘤標本的分期有高度相關性 (P<0.01),F(xiàn)Q-PCR方法對MDR1基因的檢測可以輔助病理分期,指導臨床治療。



        9. 結語

        FQ-PCR是在臨床上廣泛應用的一種基因定量檢測技術,它不但能夠準確定量腫瘤相關基因的表達,還可以對外周血中腫瘤標志物進行準確定量,據(jù)此可以對腫瘤早期診斷與腫瘤分期、分型,以及實現(xiàn)對腫瘤轉移的早期發(fā)現(xiàn)及預后判斷。因此FQ-PCR技術在臨床上將有更加廣闊的應用前景。



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