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【摘要】  目的 構(gòu)建常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征（AREP）PINK1基因真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定表達(dá)PINK1蛋白的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞株。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，以人胎腦cDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增PINK1基因全長(zhǎng)cDNA編碼區(qū)序列，重組DNA技術(shù)定向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-his(-)B，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，通過(guò)G418篩選，挑選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆株，經(jīng)提取gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及Western blot 法檢測(cè)PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，經(jīng)提取gDNA擴(kuò)增、RT-PCR及Western blot檢測(cè)到了野生型PINK1基因在基因組的整合、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)。結(jié)論 構(gòu)建了PINK1基因真核表達(dá)載體和穩(wěn)定表達(dá)PINK1蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究PINK1基因功能及AREP發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型。

【關(guān)鍵詞】  常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征；PINK1；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；SH-SY5Y細(xì)胞

　　Establishment of stable expression of wild-type PINK1 protein SH-SY5Y cell line

　　YUAN Xiang-li，ZHANG Yu-hu，LIAO Shu-sheng，et al

　　1.Department of Neurology，Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410008，China

    Abstract:  Objective  To construct the eukaryotic expression vector of autosomal recessive early-onset parkinsonism (AREP) wild type PINK1 gene and to establish human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) stably-expressing PINK1 protein.Methods  The full length PINK1 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and eukaryotic expression vector pcDNA3.1-myc-his-(-)B was inserted.After the identification by digestion and sequencing analysis,the recombinant vector was transfected into SH-SY5Y cell,and the positive mono-clone was screened by G418.The conforming of PINK1 in DNA level was identified by PCR,PINK1 mRNA transcription was detected by RT-PCR，PINK1 protein expression was assessment by western blotting in the positive mono-clones.Results  PINK1-pcDNA3.1-myc-his(-)B eukaryotic expression vector was constructed successfully,and the stable expression of wild-type PINK1-transfected SH-SY5Y cell line was established successfully.Conclusion  The construction of stable expression of wild-type SH-SY5Y cell line can provide a basis for further research on the function of PINK1 and pathogenesis of AREP.

    Key words:  autosomal recessive early-onset parkinsonism;PINK1;stable transfection;SH-SY5Y cell
   
    帕金森病是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，大部分呈散發(fā)性，致病原因不明，近幾年臨床和分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了呈單基因遺傳方式的家族性帕金森病，至少已有7個(gè)致病基因被克隆，其中常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征（autosomal recessive early-onset parkinsonism,AREP）有3種基因型（PARK2、PARK6和PARK7），致病基因分別是PARKIN、DJ-1和PINK1基因［1-3］。PINK1基因突變是AREP的常見(jiàn)原因，僅次于PARKIN［4-5］，PINK1蛋白定位于線粒體上，由581個(gè)氨基酸組成，有1個(gè)34個(gè)氨基酸組成的線粒體定位結(jié)域（mitochondrial targeting motif,MTM）和1個(gè)高度保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（156～509位氨基酸），PINK1基因的功能目前仍不清楚。本研究旨在建立穩(wěn)定表達(dá)野生型PINK1蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究PINK1基因的功能和AREP的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料 

　　脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine TM2000和pcDNA3.1-myc-his(-)B購(gòu)自Invitrogen公司；pcDNA3.1-myc-his(-)B質(zhì)粒載體購(gòu)自Invitrogen公司；各種內(nèi)切酶購(gòu)自New England BioLab公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；引物合成由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)Promega公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自PAA公司；OMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；G418購(gòu)自 Amresco公司；SH-SY5Y由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所腦與認(rèn)知國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自PIERCE公司；His標(biāo)簽抗體購(gòu)自Santa Cruzu公司；羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超敏發(fā)光液購(gòu)自PIERCE公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

　　根據(jù)PINK1基因CDS序列設(shè)計(jì)2條外引物（Pfw-Ⅰ和Prv-Ⅱ），用來(lái)做初級(jí)PCR，在外引物兩側(cè)設(shè)計(jì)2條內(nèi)引物（PINK1-1-up和PINK1-2-dn）用來(lái)做次級(jí)PCR。在正向引物PINK1-1-up加上1個(gè)EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)（GAATTC），并加上包含Kozak共有序列的起始密碼子（ACCATGG）以增強(qiáng)翻譯起始功能；反向引物PINK1-2-dn加上1個(gè)Bam H Ⅰ酶切位點(diǎn)（GGATCC），使得次級(jí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his(-)B后，融合載體上的myc-his，并使其讀框不變。以EcoR Ⅰ和Bam H Ⅰ雙酶切鑒定，采用通用引物進(jìn)行3個(gè)反應(yīng)的雙向測(cè)序鑒定。

　　1.2.2  SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染 

　　轉(zhuǎn)染前1 d將SH-SY5Y接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟如下：5 μg不同質(zhì)粒（空載體、野生型）+250 μL OMEM培養(yǎng)基混勻?yàn)锳液，12 μL Lipofectamine TM 2000+250 μL OMEM培養(yǎng)基混勻?yàn)锽液，室溫15 min，將A液與B液輕微混勻?yàn)镃液，室溫30 min；將6孔板培養(yǎng)基吸出，無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗2遍,將無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基加入C液中輕輕混勻，緩慢加入6孔板中，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，100%濕度條件下培養(yǎng)5 h，棄去培養(yǎng)基，換為含血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，24 h后換為含血清含抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入含800 μg·L-1 G418的DMEM完全培養(yǎng)基，1周后見(jiàn)對(duì)照孔的細(xì)胞大量死亡，轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，將轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞接種于96孔板，用連續(xù)稀釋法挑選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，每個(gè)96孔板大約可以挑選出6～10個(gè)單克隆，待單克隆細(xì)胞在96孔中生長(zhǎng)至80%融合，用胰酶消化后接種于6孔板中，G418濃度降為600 μg·L-1,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后傳入90 mm2培養(yǎng)皿中，待做進(jìn)一步的鑒定。將穩(wěn)定表達(dá)野生型PINK1蛋白的單克隆命名為PINK1-SY5Y細(xì)胞株。

　　1.2.3  PINK1基因DNA水平的檢測(cè) 

　　收集培養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)約106～107，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，設(shè)計(jì)上游引物PINK1-myc-His-F：5′-CCAA-GCTGGCTAGCGTTTAAACG-3′ 融合His標(biāo)簽下游引物PINK1-myc-His-R：5′-ATGGTCGACGGCGCTATTCAG-3′，在10 μL反應(yīng)體系中加入gDNA模板1 μL，10×PCR緩沖液1 μL，dNTP 0.2 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA多聚酶0.2 μL，PCR H2O補(bǔ)足10 μL，采用Touch-down方式行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 60 s；68 ℃ 30 s；每個(gè)循環(huán)下降1 ℃；72 ℃延伸1 min,10個(gè)循環(huán)；然后95 ℃、30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物約為1.8 kb大小，行瓊脂糖凝膠電泳。

　　1.2.4  PINK1基因mRNA的檢測(cè)
 
　　收集對(duì)經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確的單克隆細(xì)胞，計(jì)數(shù)約106～107，按照試劑盒說(shuō)明抽提制備總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 的OD值，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增，確定所提取的總RNA無(wú)降解后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備第一鏈cDNA，PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)。具體操作步驟如下：采用Trizol一步法快速提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞的總RNA，于55 ℃，60 min合成第1鏈，以P1、P2為模板，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行跨外顯子RT-PCR的檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)；然后72 ℃充分延伸20 min；同時(shí)設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞作為陰性對(duì)照。目的基因PCR產(chǎn)物用1 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分析。

　　1.2.5  PINK1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 
　　
　　采用抗His抗體來(lái)檢測(cè)PINK1蛋白的表達(dá)情況。具體方法為：待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合，收集并裂解細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度，稀釋使蛋白濃度為1 mg·mL-1,100 ℃變性5 min,行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，與1500稀釋的鼠抗His抗體4 ℃搖床孵育過(guò)夜，PBS-T洗膜4次，每次15 min，然后與15 000稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，室溫?fù)u床孵育1 h,PBS-T洗膜6次，每次15 min，發(fā)光液均勻涂于膜上，曝光3～5 min后顯影，將顯影條掃描。

　　2  結(jié)果

　　2.1  重組質(zhì)粒的酶切鑒定 

　　PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B質(zhì)粒酶切后野生型PINK1產(chǎn)生約1.7 kb的條帶，PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B重組質(zhì)粒中的插入片斷與GeneBank中報(bào)道的PINK1 cDNA序列完全一致,將其野生型命名為PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B。見(jiàn)圖1。

　　2.2  PINK1基因DNA的表達(dá) 

　　轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的SH-SY5Y細(xì)胞，未擴(kuò)增出目的基因片斷，轉(zhuǎn)染野生型PINK1基因的單克隆，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度約1.8 kb，并可見(jiàn)轉(zhuǎn)染野生型PINK1基因的假陽(yáng)性克隆,PINK1基因CDS全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖2。

　　2.3  PINK1基因mRNA的表達(dá) 

　　提取的總RNA OD260/280值均大于1.9，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S、18S、5S 3條核糖體RNA泳帶完整清晰，表明總RNA無(wú)明顯降解，見(jiàn)圖3。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物可見(jiàn)野生型PINK1產(chǎn)生約425 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中未擴(kuò)增出425 bp產(chǎn)物的為假陽(yáng)性克隆，正常轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的SH-SY5Y細(xì)胞組中未見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物表達(dá)。見(jiàn)圖4。
　　
　　2.4  PINK1蛋白的表達(dá) 

　　正常SH-SY5Y細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的SH-SY5Y細(xì)胞組未見(jiàn)到PINK1-His融合蛋白條帶，轉(zhuǎn)染野生型PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B重組質(zhì)粒載體的SH-SY5Y細(xì)胞組可見(jiàn)特異性的分子量約為62 000的目的條帶,見(jiàn)圖5。

　　3  討論

    用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型是研究帕金森病發(fā)病機(jī)制的重要途徑，目前將基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀等生化轉(zhuǎn)染方法、電穿孔物理轉(zhuǎn)染方法以及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，容易透過(guò)細(xì)胞膜，在體外基因轉(zhuǎn)染中有較高的效率，是目前常用的的轉(zhuǎn)染方法之一。作者選擇了pcDNA3.1-myc-his(-)B 質(zhì)粒載體來(lái)構(gòu)建野生型PINK1真核表達(dá)載體，引入標(biāo)記物His以便于檢測(cè)。構(gòu)建的載體PINK1-His融合表達(dá)蛋白載體，由于PINK1蛋白的單克隆抗體來(lái)源困難，因此采用抗His抗體來(lái)檢測(cè)PINK1蛋白的表達(dá)情況。His是一種分子量很小的標(biāo)記物，大小約為相對(duì)分子質(zhì)量1 000左右，與目的蛋白融合在一起所形成的融合蛋白基本上具有目的蛋白所有的生物學(xué)功能，一般不會(huì)改變目的蛋白的運(yùn)輸、組裝、分泌和代謝等正常生理功能。

    PINK1基因是2004年克隆的與AREP相關(guān)的基因［3］，是AREP的常見(jiàn)致病基因，僅次于PARKIN基因，是由581個(gè)氨基酸組成的高度保守的鈣調(diào)蛋白激酶家族成員，是鈣調(diào)蛋白激酶的類似物，在人腦中廣泛表達(dá)，定位在線粒體膜上，有1個(gè)34個(gè)氨基酸組成的N末端線粒體定位結(jié)構(gòu)域和1個(gè)354個(gè)氨基酸組成的絲-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域及1個(gè)C-末端自動(dòng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，在體外有自磷酸化作用，PINK1蛋白溶解度極低并有聚集的特性［6-8］，這可以解釋為什么散發(fā)性PD患者中10%的路易體內(nèi)可以檢測(cè)到PINK1 蛋白。

    PINK1基因功能缺失突變約占早發(fā)性PD患者1%～7%，目前已經(jīng)有20余種突變報(bào)道，PINK1基因雜合突變也有報(bào)道，被認(rèn)為也是晚發(fā)性PD的危險(xiǎn)因素，PINK1 基因的發(fā)現(xiàn)第1次使線粒體功能障礙與AREP間有了直接聯(lián)系的證據(jù)。過(guò)表達(dá)PINK1蛋白可以阻止細(xì)胞線粒體膜電位下降及MG123誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［3，9］，而過(guò)表達(dá)PINK1致病突變（E240K，L489P and K219M）可以使PINK1功能失活而不能保護(hù)細(xì)胞在基礎(chǔ)及誘導(dǎo)情況下的細(xì)胞凋亡。PINK1基因突變的表型與PARKIN非常相似，過(guò)表達(dá)PARKIN可以挽救由PINK1突變導(dǎo)致的線粒體功能障礙［10-11］。在正常及凋亡應(yīng)激情況下，過(guò)表達(dá)野生型PINK1基因通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放及相應(yīng)的caspase激活起到抗SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用。RNA干擾調(diào)節(jié)的PINK1基因失活果蠅模型導(dǎo)致進(jìn)行性多巴胺神經(jīng)元丟失，抗氧化劑SOD可以抑制這種神經(jīng)變性，表明PINK1基因失活后可以通過(guò)氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。PINK1基因很可能通過(guò)磷酸化某些線粒體蛋白，調(diào)節(jié)它們的功能而發(fā)揮其保護(hù)作用。TNF-受體相關(guān)蛋白1，一種線粒體分子伴侶，也被稱為熱休克蛋白75，是目前報(bào)道的PINK1的細(xì)胞內(nèi)下游底物，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)PINK1與HTRAP1在線粒體結(jié)合并磷酸化HTRAP1，保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，證明PINK1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制依賴于對(duì)HTRAP1的磷酸化［12］。PINK1基因功能的進(jìn)一步研究對(duì)于揭示AREP的發(fā)病機(jī)制及靶點(diǎn)治療具有非常重要的意義。

    本研究以人胎腦cDNA文庫(kù)為模板獲得PINK1基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，插入到pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表達(dá)載體內(nèi)，PINK1基因CDS全長(zhǎng)1 746 bp，5′端GC含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故采用2次PCR以獲得其CDS全長(zhǎng)，成功構(gòu)建了野生型PINK1基因的真核表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)過(guò)G418篩選陽(yáng)性單克隆株，提取全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、Western blotting 檢測(cè)到PINK1基因在DNA、mRNA水平的整合、轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的表達(dá)。綜上所述，本研究成功建立了在基因組DNA中穩(wěn)定整合有野生型PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B載體的SH-SY5Y細(xì)胞株，為PINK1基因的功能研究提供了1個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，為 PINK1基因的功能特性及與AREP發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)。

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