一、 檢測(cè)原理：
Tag-lite是SNAP-Tag與HTRF技術(shù)相結(jié)合，用來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞表面受體分析的一種技術(shù)。SNAP技術(shù)由Covalys公司開發(fā)出來(lái)，并由NEB公司實(shí)現(xiàn)商品化。
SNAP和CLIP是小的融合標(biāo)簽蛋白，可特異地與底物通過(guò)芐甲基不可逆共價(jià)結(jié)合，其底物分別為芐甲基鳥嘌呤（BG）和芐甲基胞嘧啶（BC）。由于底物可與各種染料形成衍生物，這樣，通過(guò)共價(jià)反應(yīng)，染料就標(biāo)記到SANP或CLIP上了（見(jiàn)圖1）。
與蛋白質(zhì)組學(xué)一線專家面對(duì)面，趕快報(bào)名參加第二期蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與應(yīng)用高級(jí)培訓(xùn)班！
SNAP或CLIP可以非常容易地融合到蛋白質(zhì)的N端或C端，所以我們可以構(gòu)建SNAP或CLIP與目標(biāo)蛋白的表達(dá)載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、融合蛋白表達(dá)后，加入標(biāo)記了熒光染料的底物，我們可以得到標(biāo)記了熒光染料的目標(biāo)蛋白。
在Tag-lite技術(shù)中，用pSNAP或pCLIP與編碼目標(biāo)GPCR的基因構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，就可表達(dá)N端融合了SNAP或CLIP的目標(biāo)GPCR（見(jiàn)圖2）。
底物（BG或BC）與HTRF熒光染料反應(yīng)形成衍生物，例如與供體(Donor)鋱穴狀化合物（Lumi4®-Tb）形成衍生物，SANP-GPCR或CLIP-GPCR融合蛋白與其反應(yīng)，則Tb被標(biāo)記到GPCR上。加入受體(Acceptor)熒光染料標(biāo)記的配體，可以進(jìn)行受體配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模琀TRF的能量受體（Acceptor）與底物形成衍生物，則Acceptor被標(biāo)記到GPCR上，可以進(jìn)行GPCR同源二聚化實(shí)驗(yàn)。除此之外，我們還可以進(jìn)行GPCR異源二聚化實(shí)驗(yàn)、寡聚化實(shí)驗(yàn)以及內(nèi)源化實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞表面受體分析。
圖1： GPCR-SNAP與Tb穴狀化合物結(jié)合。表達(dá)在GPCR N端的SNAP與底物-Tb的芐甲基反應(yīng)。
圖2：SNAP與GPCR在N端形成融合蛋白。首先構(gòu)建編碼GPCR和SNAP的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。
二、Tag-lite技術(shù)的檢測(cè)波長(zhǎng)
Tag-lite技術(shù)利用Tb作為能量供體，其發(fā)射光譜見(jiàn)圖3。從圖中我們可以看出，綠色或紅色熒光都可以作為Tb的能量受體。這樣一種組合，能夠提供更高的信噪比，原因如下：1）Tb穴狀化合物具有較長(zhǎng)的生命周期，可以時(shí)間分辨熒光的模式檢測(cè)。在這種模式下，所有的自發(fā)熒光都不會(huì)被檢測(cè)到；2）作為能量供體的Tb，在520 nm和665 nm的發(fā)射信號(hào)非常低，而這正是能量受體的檢測(cè)波長(zhǎng)，所以來(lái)自Tb的干擾很小。
圖3：Tag-lite技術(shù)的檢測(cè)波長(zhǎng)
三、檢測(cè)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)
1. 可用于所有GPCR受體配體結(jié)合分析的平臺(tái)，構(gòu)建的細(xì)胞可用于所有功能性檢測(cè)（見(jiàn)圖4），并且可檢測(cè)受體的二聚化、寡聚化和內(nèi)源化等等
2. SNAP或CLIP的熒光染料標(biāo)記的底物不能進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)部不會(huì)有信號(hào)產(chǎn)生而對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾
3. SNAP和CLIP的底物非常特異，不與其它蛋白成分發(fā)生反應(yīng)，SNAP和CLIP可同時(shí)表達(dá)在細(xì)胞表面
4. 基于HTRF技術(shù)，背景低，假陽(yáng)性率低
5. 均相檢測(cè)，可用于高通量篩選
6. 可采用肽或非肽類的熒光配體
7. 無(wú)放射性
圖4：抗利尿激素在COS-7細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生肌醇-1-磷酸（IP-One）
分別檢測(cè)野生型V1A（WT-V1A）和SNAP-Tag-V1A（ST-V1A）誘導(dǎo)表達(dá)的情況，其EC50非常相近，表明SNAP融合蛋白不會(huì)對(duì)GPCR功能產(chǎn)生影響。
四、應(yīng)用領(lǐng)域
活細(xì)胞表面受體分析，包括受體配體結(jié)合、受體同源二聚化、受體異源二聚化，受體寡聚化、受體內(nèi)源化檢測(cè)等等。
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孫翠巍
謝 兵
