Tharmac® Cellspin 載玻片離心機(jī)簡介 （點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入詳細(xì)）
胚胎冷凍儀 （點(diǎn)擊進(jìn)入）
我們實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)層細(xì)胞STO的傳代
1.當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個平皿(100mm)后,吸棄舊培養(yǎng)液，10mLPBS洗一遍
2.0.25%胰酶（預(yù)熱20分鐘左右）2ml消化，輕輕搖晃，直至肉眼見單層細(xì)胞呈塊狀脫落（或在顯微鏡下觀察細(xì)胞之間分離），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)終止消化，輕柔吹打8-10次成單細(xì)胞。
3.離心1000rpm*5min,棄上清，加DMEM+10%FBS輕柔吹打。
4.將細(xì)胞懸液1:4傳到100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個皿加10ml(DMEM+10%FBS)培養(yǎng)液，正常情況下2-3天就可以長滿，期間不用換液。
小鼠ES-R1細(xì)胞系傳代。
因?yàn)槲覀冇蔑曫B(yǎng)層細(xì)胞鋪皿而不是明膠包被，所以傳代之前必須處理飼養(yǎng)層細(xì)胞。
1.飼養(yǎng)層細(xì)胞STO處理：當(dāng)STO鋪滿平皿后，向培養(yǎng)液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作時不要接觸，作用是抑制STO增殖)，輕輕搖晃平皿，保證絲裂霉素分布均勻，放置于培養(yǎng)箱中處理2h后，吸棄培養(yǎng)液，10mlPBS洗兩遍（目的是把mitomycinC洗凈），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)終止，離心1000rpm*5min棄上清，加DMEM+10%FBS后吹打均勻，種到新的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)齊培養(yǎng)液至10ml。置于培養(yǎng)箱中過夜。
2.第二天早上傳干細(xì)胞：
（1）吸棄舊培養(yǎng)液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，邊消化邊輕輕晃動培養(yǎng)皿，4-5min后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)部分細(xì)胞脫落，成小的細(xì)胞團(tuán)塊，加8ml DMEM+10%FBS終止消化，輕柔吹打。
（2）然后將液體轉(zhuǎn)移到15ml塑料離心管中，靜置10-15min，吸棄上清，加2mlES培養(yǎng)液。
（3）將滴管在酒精燈下拉成非常細(xì)的玻璃管，吹打1－2次，盡量將ES吹散
（4）將前一天鋪好的STO的培養(yǎng)液吸棄，換成10ml的ES培養(yǎng)液（操作要小心，不然STO很容易脫落），再把塑料離心管中的ES1:3或1:4(視情況而定)傳到鋪好的STO皿中，前后左右垂直晃動幾下，使干細(xì)胞分布均勻，置于培養(yǎng)箱中，每天換液，兩到三天傳代。
應(yīng)該注意的問題：
1.STO不管是在ES傳代還是換液過程中都可能因?yàn)榧右后w速度過快而脫落，所以最好靠近培養(yǎng)皿壁先一滴一滴加，避免液體直接打在STO上。
2.玻璃管拉得盡量細(xì)一些。
3.一定要把mitomycin洗干凈
我養(yǎng)過很多細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都有，總的感覺是腫瘤細(xì)胞要比正常細(xì)胞好養(yǎng)。先介紹一下目前手頭正在養(yǎng)的兩株細(xì)胞。
SNU-398:人肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)液是1640+10mmol/LHEPES+1mmol/L丙酮酸鈉+1.5g/L碳酸氫鈉+10％FBS
PLC/PRF/5：人肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)液是EMEM+0.1mmol/L非必需氨基酸+1mmol/L丙酮酸鈉+1.5g/L碳酸氫鈉+10％FBS
消化液是0.25％胰酶+0.03％EDTA
兩株細(xì)胞都是貼壁細(xì)胞，SNU－398消化時需先加入1ml（25cm2）消化液，使消化液均勻覆蓋瓶底后倒掉，然后再加入1ml消化液，室溫放置3分鐘左右，加入培養(yǎng)液8ml中止消化，吹打使細(xì)胞分散（動作要輕，避免氣泡），再分別將細(xì)胞液各3ml加入另外兩個新瓶子，添加培養(yǎng)液至8ml/瓶，繼續(xù)培養(yǎng)
PLC/PRF/5消化時只需加入1ml（25cm2）消化液，使消化液均勻覆蓋瓶底后靜置5分鐘左右，輕拍培養(yǎng)瓶幾下，然后加入培養(yǎng)液，一般也是一傳三，操作同SNU-398。
小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的消化及傳代，RAW264.7因是單核巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特性就是貼壁特別牢。
我得操作如下：
實(shí)驗(yàn)前將DPBS及DMEM加溫到37度
使用Flask75培養(yǎng)瓶：
1、細(xì)胞貼壁生長，長滿瓶底70％時，棄去培養(yǎng)液，加DPBS10ml漂洗 一至兩次；棄去
2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher輕輕刮即可，離心后去除DPBS.用DMEM培養(yǎng)液10ml復(fù)吹打混懸細(xì)胞
3.分入新的培養(yǎng)瓶；
4. 入37℃5％CO2孵箱，幾小時后即可再貼壁 。
細(xì)胞生長很好。
我來談?wù)凥epG2細(xì)胞株的傳代經(jīng)驗(yàn)：
首先在倒置顯微鏡下觀察生長融合達(dá)80%，不需要長滿，就準(zhǔn)備傳代。倒掉舊的培養(yǎng)基，再用已經(jīng)高壓滅菌過的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培養(yǎng)瓶，加入1毫升已經(jīng)配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過濾，再用一次性過濾器過濾除菌，再分裝成1ml的小包裝，剛好每次用完一個，避免每次反復(fù)凍存，會使胰酶的活性下降），加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變園收縮，大約1－3分鐘時間，必要時可以吹打幫助細(xì)胞分散，就立即加入培養(yǎng)基中和胰酶，如有EDTA最好要離心（800rpm,5min)，棄上清夜，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37度培養(yǎng)24小時后觀察。
細(xì)胞：vero(非洲綠猴細(xì)胞)
PK-15[豬腎細(xì)胞（表示要到第15代細(xì)胞才會穩(wěn)定)]
類型：貼壁細(xì)胞
來源：購自武漢病毒所細(xì)胞保存中心
由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心繁殖保存
傳代步驟：
棄去舊的生長液-->用無鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細(xì)胞數(shù)次(視細(xì)胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細(xì)胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長液,拍打吸吹下細(xì)胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號,放入37度二氧化碳溫箱生長
細(xì)胞特點(diǎn):vero細(xì)胞生命力強(qiáng),在很多其他細(xì)胞被污染的不能在繼續(xù)做的時候,它還能頑強(qiáng)的活下去,但是它有個特點(diǎn)就是對ATV很敏感,一般陪的較好的ATV一下去它能在較短的時間內(nèi)消化下來,這是在消化時要注意的問題;PK-15相對就沒有那么好傳了,它和 VERO剛好相反,它的消化要很長的時間.我在作實(shí)驗(yàn)時選擇的最多的是MDBK,因?yàn)樗鼜埖淖羁?其次選擇VERO因其生命力強(qiáng);最后在選PK-15和IBRS、BHK21等這些細(xì)胞?。?！
我養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞腫瘤細(xì)胞(A549,SKBR3,MCF7):
根據(jù)細(xì)胞生長狀況3天左右傳代一次。棄去培養(yǎng)液，并用不完全培養(yǎng)液洗一遍，再加入1~2ml 0.25% 胰酶和0.03% EDTA溶液，放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變圓收縮，（A549大概要2分鐘，MCF7大概十幾秒，SKBR3要5分鐘左右）就立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，用滴管吹打培養(yǎng)瓶壁，至細(xì)胞全部從培養(yǎng)瓶脫落，離心（1200rpm,2min)，洗滌一次，棄上清液，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，分至新的培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
注意：加了EDTA的消化液一定要離心洗滌，否則會影響細(xì)胞生長狀態(tài)
我養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549,PG)
傳代步驟？：
棄去培養(yǎng)液，并用PBS洗一遍，再加入1~2ml 0.25% 胰酶和0.03% EDTA溶液，均勻分布于瓶底，在倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變圓收縮，（A549大概要2分鐘，PG要3分鐘左右）,倒掉消化液，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打培養(yǎng)瓶壁，至細(xì)胞全部從培養(yǎng)瓶脫落，洗滌一次，棄上清液，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，分至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。兩種細(xì)胞均容易成團(tuán)生長，在傳代時要反復(fù)吹打。
我培養(yǎng)過VEC，KB-A-1/3等，現(xiàn)在養(yǎng)3T3-L1，講一些“消化”經(jīng)驗(yàn)值吧，總覺得養(yǎng)細(xì)胞除非特殊，否則都差不多的手法的，當(dāng)然這里我不提不同培養(yǎng)基了。
我的通常做法：細(xì)胞棄去上清培養(yǎng)基，PBS洗3次，0.125%胰蛋白酶加1ml，平晃培養(yǎng)瓶潤濕后立即倒去胰酶，接著就根據(jù)細(xì)胞不同性質(zhì)等待消化的時間不同了，難消化的細(xì)胞（如KB）可以37度培養(yǎng)箱溫育片刻，一般2-3min都可以了，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化稀釋傳代就行了。
關(guān)鍵是潤濕后馬上棄去胰酶，這樣可以保證消化質(zhì)量，也可以很大程度上避免消化脫落的細(xì)胞過后倒去胰酶是損失了。
神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)
(Primary dissociated cell culture)
從動物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生動物的腦組織取下某一局部區(qū)域，分離細(xì)胞，培養(yǎng)在培養(yǎng)容器后不再移植，常稱為原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。
一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備
1. 器械和器皿
器械：外科剪、鑷子、虹膜剪等、小剪刀、細(xì)鑷子和虹膜小刀等
各種金屬器械如解剖器械，使用后及時刷洗干凈，用酒精棉球擦拭后晾干，或經(jīng)60°C烘干，以防生銹。由于濕熱消毒對手術(shù)器械容易可用70－80％酒精浸泡1小時以上消毒。
器皿：1) 玻璃瓶及相應(yīng)的膠塞或膠木螺旋蓋
用于分裝血清、多聚賴氨酸、解剖液、各種鹽溶液和培養(yǎng)液等。
2) 培養(yǎng)瓶、蓋玻片
培養(yǎng)用的蓋玻片必須不含鉛、不發(fā)霉，可用0.2N鹽酸浸泡10分鐘，用蒸餾水洗2次，每次10分鐘，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分鐘，再用雙蒸水洗2次，每次10分鐘，烘干待消毒。凡組織學(xué)用過的舊蓋玻片一般不用。
3) 移液管、吸管、燒杯、離心管和培養(yǎng)皿。
4) 塑料培養(yǎng)皿（35mm）、塑料培養(yǎng)板（6、24、96孔）。
輔助工具：放置試管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培養(yǎng)基和培養(yǎng)用液的配制
1) 培養(yǎng)基質(zhì)：有多聚賴氨酸、牛皮膠原和鼠尾膠原。本室目前常用分子量為7-140，000多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，濃度為0.1mg/ml。
2) 平衡鹽溶液：主要以無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成。各種平衡鹽溶液主要的不同點(diǎn)在于NaCl的濃度、離子濃度及緩沖系統(tǒng)的不同，可根據(jù)實(shí)際需要選用適當(dāng)?shù)钠胶恹}溶液。
3) 培養(yǎng)液：目前已有現(xiàn)成的干粉出售，按說明書進(jìn)行配制即可。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)需高糖，培養(yǎng)液應(yīng)含有或加葡萄糖至6g/L。目前培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可選用B27無血清培養(yǎng)液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和馬血清等。分裝成小瓶，4°C保存?zhèn)溆茫ǚ盅b前需56°C滅活30分鐘）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分離細(xì)胞。先用少量滅菌三蒸水將胰蛋白酶粉末溶成糊狀，然后補(bǔ)水至2.5%濃度，振蕩搖勻，4°C過夜，待完全溶解后用濾器過濾滅菌，并分裝成1~2ml凍存。用前以D-Hanks平衡鹽水或其他無鈣鎂離子溶液溶解稀釋至0.25%或0.125%。實(shí)際使用溫度一般為37°C 20~30分鐘。
6) 解剖溶液：由平衡鹽水（D1-無鈣鎂離子的Puck氏液）、HEPES緩沖液和蔗糖－葡萄糖溶液組成稱為D1-SGH。
D1平衡鹽水：NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO4.7H2O 0.045g、KH2PO4 0.03g、酚紅0.0012g、三蒸水50ml。
蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。
HEPES（H，0.352mM）：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl調(diào)pH至7.3~7.4，加三蒸水至28ml。
將D1、SG和H三者合在 一起并稀釋到1000ml即為解剖液，小瓶分裝成5ml置4°C 備用。
二、培養(yǎng)細(xì)胞操作
1. 涂培養(yǎng)基
一般在細(xì)胞培養(yǎng)前1~2天，將使用的塑料培養(yǎng)皿（35mm）、24孔、96孔培養(yǎng)板或消毒的蓋玻片涂上一層Poly-L-Llisine，置于超凈臺中備用。
2. 實(shí)驗(yàn)動物準(zhǔn)備
動物的年齡和取材部位對培養(yǎng)細(xì)胞的成活率關(guān)系密切，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定。如大鼠海馬細(xì)胞培養(yǎng)，以18天胚胎或新生48小時內(nèi)的大鼠為宜，而培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)與脊髓神經(jīng)元以11~13天胚胎小鼠、大腦皮層以小鼠16~21天、小腦細(xì)胞取自臨產(chǎn)或新生動物。
3. 進(jìn)入培養(yǎng)室操作
1) 穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。
2) 安放消毒的實(shí)驗(yàn)用具，如培養(yǎng)皿、解剖器械、玻璃吸管、培養(yǎng)板等于桌面適當(dāng)?shù)奈恢谩?br />
3) 將平衡鹽水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同時準(zhǔn)備一個冰袋和污物盤。
4) 解剖動物以新生大鼠取海馬組織為例：將新生大鼠投入80％的酒精中，消毒5~10分鐘。用解剖剪斷頭，并移入玻璃器皿中，沿中間骨縫將頭骨剪開（頭骨外側(cè)下沿也剪開），然后剝開頭骨暴露大腦半球，去腦膜，沿中線將大腦半球往外翻開，暴露內(nèi)側(cè)面半月狀的海馬組織。用彎頭鑷子輕輕夾起，放入解剖液內(nèi)（培養(yǎng)皿可置于冰袋上）。待數(shù)個動物均解剖后，將培養(yǎng)皿內(nèi)的海馬組織移至解剖鏡下，仔細(xì)去除血管、膜及非海馬結(jié)構(gòu)（取材干凈非常重要）后，再移至小培養(yǎng)皿中，加數(shù)滴D1-SGH液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。
5) 在上述海馬組織加入解剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml，搖勻后置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化25~30分鐘。
6) 將消化好的細(xì)胞碎片移入2ml的離心管中，吸去剩余的胰蛋白酶溶液，加入含血清的全培養(yǎng)液2ml終止胰酶作用，約10分鐘后，再更換一次全培養(yǎng)液以洗凈胰酶。（全培養(yǎng)液成份為80％DMEM、10％胎牛血清、10％馬血清或小牛血清，胎牛血清有助于細(xì)胞貼壁）。
7) 用口徑較小的、在火焰上光滑過的玻璃吸管吸取細(xì)胞團(tuán)，移入另一離心管，加入2ml培養(yǎng)液并吹打20次。將離心管斜放，讓細(xì)胞碎片下沉5~10分鐘后，吸取上層細(xì)胞溶液約1ml。離心管中再加入培養(yǎng)液1ml，同上吹打并吸取細(xì)胞，與第1次吸取的細(xì)胞混合一起后計(jì)數(shù)。
8) 按所需的細(xì)胞濃度接種在事先準(zhǔn)備的塑料培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板中，用蓋玻片則需滴滿。接種后移入37°C的5％CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1天后可用無血清培養(yǎng)液，1星期換液2次。
三、細(xì)胞識別
根據(jù)細(xì)胞外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞的識別。神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的特征，培養(yǎng)中的貼壁的神經(jīng)元突起很明顯，特別是樹突由粗而細(xì)，有分支，突起的末端有膨大的生長錐結(jié)構(gòu)，正在不斷變化；細(xì)胞體呈圓形、梭形、三角形或多角形不等，胞體較厚，具有空泡狀核，有明顯的核仁；立體感強(qiáng)，常見“暈”。
培養(yǎng)細(xì)胞中可包括幾種神經(jīng)元的類型和非神經(jīng)元的“背景細(xì)胞”，即成纖維細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和幾種膠質(zhì)細(xì)胞。
成纖維細(xì)胞貼壁最快，呈扁平狀，胞核卵園形，有并列的兩粒小核仁，從胞體兩端發(fā)出細(xì)長突起。膠質(zhì)細(xì)胞貼附在膠原上和成纖維細(xì)胞形成一層“地毯”。神經(jīng)細(xì)胞貼壁較慢，落在“地毯”上生長遷移和分化。
培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞可按一般Nissl法染色或免疫細(xì)胞化學(xué)特異性染色加以鑒別。
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
細(xì)胞儲存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲存時間是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。
細(xì)胞的凍存
【用品】
（1） 5%胰蛋白酶
（2） 含10%~20%血清培養(yǎng)液
（3） DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（15磅蒸汽高壓消毒）
（4） 吸管、離心管、凍存管
【步驟】
（1） 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細(xì)胞，已經(jīng)長滿的細(xì)胞凍存后生存率低。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。
（2） 用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管并計(jì)數(shù)，離心。
（3） 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含10%DMSO或甘油），凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中。
（4） 裝完細(xì)胞后的凍存管即可直接凍存。以本教研室對L929的凍存程序作為大家進(jìn)行細(xì)胞凍存的參考：將凍存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面過夜。以后取出凍存管移入液氮容器內(nèi)。在放入液氮時，要帶手套操作以免凍傷。
細(xì)胞在液氮中儲存時間理論上是無限的，但為妥善起見，特別是很多為被凍存過的細(xì)胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇一次觀察細(xì)胞對凍存的適應(yīng)性。已建系的細(xì)胞最好也每年取一支復(fù)蘇一次后，再繼續(xù)凍存。
細(xì)胞的復(fù)蘇
【用品】培養(yǎng)液，吸管，離心管，培養(yǎng)瓶，37℃溫水
【步驟】
（1） 從保存凍存管的支架中取出凍存管應(yīng)直接投入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。如果凍存管密封不嚴(yán)，在保存過程中液氮進(jìn)入凍存管中，從液氮罐中取出時由于溫度升高導(dǎo)致液氮急速氣化而爆炸，可能會危及面部等。因此，存取凍存管時都要佩戴眼鏡和手套。
（2） 從37℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后，擰開凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，在重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。
（3） 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時細(xì)胞密度較高要及時傳代。
細(xì)胞復(fù)蘇時細(xì)胞數(shù)可以做10~20倍稀釋，接種密度以5×105/ml為宜。
細(xì)胞株的傳代與培養(yǎng)
培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長細(xì)胞如COS-7、CHO等用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞如PC12用直接吹打即可傳代。下面主要介紹貼壁細(xì)胞的傳代。
一、用品
(1) 0.25％胰蛋白酶，全培養(yǎng)液
(2) 滴管，離心管，培養(yǎng)瓶(皿)，培養(yǎng)瓶蓋，注射器，計(jì)數(shù)6
皮乳頭
二、步驟
(1) 貼壁細(xì)胞的消化法傳代：
① 吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
② 以50ml培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入2-3ml胰蛋白酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。
③ 消化最好在37C或室溫25C以上環(huán)境下進(jìn)行。消化后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察．發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后。應(yīng)立即終止消比，然后吸掉消化液后再加全培養(yǎng)液終止消化。
④ 用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底的一端開始到另一端結(jié)束，以保證所有的底部都被吹到。吹打動作要輕柔同時盡可能不要出現(xiàn)泡沫。這些都對細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。
⑤ 計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。
部分貼壁生長細(xì)胞，不經(jīng)消化處理直接吹打也可使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，而進(jìn)行傳代。但這種方法僅限于部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela、PC12細(xì)胞等。直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常也有較大數(shù)目的丟失，因而絕大部分貼壁生長的細(xì)胞均需消化后，才能吹打傳代。
我養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3,貼壁生長，傳代步驟：
1.倒掉舊培養(yǎng)液，盡量倒凈。
2.如果是50ml的培養(yǎng)瓶，加入約1ml0.25％胰酶中和殘留培養(yǎng)液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以節(jié)約胰酶。
3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人體會，新開瓶（指分裝的小瓶）使用的胰酶消化能力強(qiáng)，可以減少用量至0.5－0.8ml,已用較久的胰酶如用少了就不管用。
4.鏡下觀察，如果80％以上細(xì)胞都回縮變圓，立刻將培養(yǎng)瓶豎起，防止過度消化。
5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培養(yǎng)液5ml加入瓶內(nèi)，按順序輕吹打，如瓶底由模糊變透亮，說明細(xì)胞已從瓶壁吹離。
6.此種細(xì)胞生長較快，所以一般按1傳5－6傳代，按瓶數(shù)補(bǔ)足培養(yǎng)液，吹勻后分別接種到新瓶中。
7.根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化所提示的酸堿度變化，一般2天左右換液一次。
請不要重復(fù)發(fā)帖，謝謝配合、支持！ by victoh
liguofan wrote:
養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底，就可以傳代了。一般6天左右傳一代。先倒掉舊培養(yǎng)液，用pbs2ml洗兩遍，再加入0.05%的胰酶+0.02edta，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有大部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形后即可。倒掉，加入含低濃度血清培養(yǎng)液，然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。離心后去除上清液，加全培，再分2瓶，補(bǔ)加培養(yǎng)液。
特點(diǎn)是胰酶濃度低，不預(yù)溫，消化后離心，不用pbs洗{細(xì)胞會失掉}
呵呵，看了這份帖子，我有點(diǎn)跟他不同的地方...也是平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞融合后傳代，原代要在5－7天融合，傳第一代，之后一般4、5天傳一代。棄去培養(yǎng)液，加1ml胰酶0.25％（用前37度預(yù)熱），1min后棄去，重新加1ml胰酶，顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞變圓但沒有飄起來的時候加含血清的培養(yǎng)液終止消化，一般是3min，棄去胰酶，加2ml培養(yǎng)液；或不棄去胰酶，加3ml培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞懸液，將懸液直接移入新的培養(yǎng)瓶，原來的培養(yǎng)瓶再加3ml培養(yǎng)液，一起放入孵箱培養(yǎng)。
俺養(yǎng)時間最長的就是人外周血單個核細(xì)胞－－pbmc ，所以俺才會叫pbmc這個
網(wǎng)名，嘿嘿，扯遠(yuǎn)了
pbmc是混雜的細(xì)胞群體，我的目的細(xì)胞是T 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)記錄如下
一，目的：pbmc的分離和培養(yǎng)
二，所有的試劑; 淋巴細(xì)胞分離液（TBD公司) ，小妞血清（四季青），RPMI
－1640 （GIBICO)，rIL-2(長春什么公司），二巰基乙醇（sigma），慶大霉
素（哪里產(chǎn)的都行),HEPES(忘記產(chǎn)地了），L-Glutamin（生工），丙酮酸鈉（
生工），NaHCO3， HCL
三，實(shí)驗(yàn)步驟
1，培養(yǎng)液的配制：
RPMI-1640干粉
二巰基乙醇 3.7 微升
丙酮酸鈉 110 毫克
HEPS 1 克
L－glutamin 200 毫克
慶大霉素 5萬 單位
NAHCO3 1 克
加3蒸水到1000ml,磁力攪拌器攪拌~~~~~~~~~ 調(diào)整ph植
2，淋巴細(xì)胞的常規(guī)分離（注意收集人血清備用?。?br />
3，分離的pbmc的培養(yǎng)：按照1－2 x 10 6次方的濃度，放入24孔板內(nèi)，每
孔加入細(xì)胞懸液1ml，加人血清200－300ul，rIL-2 50單位/孔，各種刺激劑按照
文獻(xiàn)加入（抗CD3,抗CD4 ，PHA等等），第3天分孔并加入rIL-2 ，50單位/孔。
最近半年一直在養(yǎng)293T細(xì)胞，其實(shí)我養(yǎng)的293T是經(jīng)過改良的，是斯坦福大學(xué)
nolan實(shí)驗(yàn)室的phenix 系列中的一種（大家自己去找找看吧，就在學(xué)校主頁里面
有）
我養(yǎng)這細(xì)胞之前，也養(yǎng)過一批293T ,是從南京醫(yī)科大學(xué)搞到的，可惜，由于沒
有經(jīng)驗(yàn)，被我養(yǎng)的半死不活，最終徹底完完了。
細(xì)胞拿來時候，我按照從網(wǎng)上和上找到的資料，用單獨(dú)的EDTA消化，
結(jié)果細(xì)胞長的非常難看，好多細(xì)小的顆粒在細(xì)胞的表面，然后細(xì)胞貼壁的情
況就不是很好，然后細(xì)胞就逐漸死掉了。后來我用直接吹打的方法，結(jié)果傳
代，動存，復(fù)蘇，都沒有問題，而且細(xì)胞狀態(tài)非常的好。我用的是DMEM＋10
％NCS（胎牛買不起?。?。凍存液配方是 4：5：1 ＝DMEM：小牛血清：DMSO
1 棄去舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液沖洗細(xì)胞兩遍
2 加入0.25%胰酶與0.02%EDTA各10滴，置顯微鏡下觀察，三分鐘后倒去消化液，再用D-Hanks液沖洗細(xì)胞兩遍。
3 加入0.25%胰酶10滴，再消化三分鐘，加血清終止消化，吹打細(xì)胞（液體不夠可適當(dāng)加入D-Hanks液）
4 離心8分鐘（1000轉(zhuǎn)/分鐘），去上清。加入D-Hanks液吹打混勻，再離心一遍。
5 加入培養(yǎng)基5毫升混勻細(xì)胞，按1：2分裝傳代！
忘記說了，我的是角質(zhì)形成細(xì)胞的傳代
不同細(xì)胞傳代方法：
1.懸浮細(xì)胞：如k562，勿需消化離心，可直接由孵箱內(nèi)取出---直立靜置1-3分鐘---吸取上層培養(yǎng)基1/3-2/3 --- 加入新配制的培養(yǎng)基（含雙抗和10%小牛血清）--- 傳代即可。
2.半貼壁細(xì)胞：如小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，勿需消化離心，先傾出瓶內(nèi)培養(yǎng)基---加入少量新配制的培養(yǎng)基（不含小牛血清）輕輕吹打均勻--- 加入新配制的培養(yǎng)基（應(yīng)將吹打前加入的培養(yǎng)基體積考慮在內(nèi)，使小牛血清濃度為10%，含雙抗）--- 傳代即可。
3.貼壁細(xì)胞：如L929，先消化離心---棄上清---加入少量新配制的培養(yǎng)基（不含小牛血清）輕輕吹打均勻--- 加入新配制的培養(yǎng)基（應(yīng)將吹打前加入的培養(yǎng)基體積考慮在內(nèi)，使小牛血清濃度為10%，含雙抗）--- 傳代即可。
注：操作過程應(yīng)嚴(yán)格無菌，OK
本人培養(yǎng)的是DG-75細(xì)胞（B淋巴瘤細(xì)胞株），為懸浮細(xì)胞，使用1640加10％新生牛血清，未加雙抗，當(dāng)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)微黃時候，肉眼可見瓶內(nèi)有細(xì)小顆粒，但整體清澈，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞成葡萄狀成串，有立體感，即液體各個層面都有大量細(xì)胞團(tuán)，是傳代的好時機(jī)。只需要吸取原培養(yǎng)液分裝到3-4個新的培養(yǎng)瓶，原瓶稍有液體覆蓋即可，各瓶再加培養(yǎng)液到8ml即可。
采用常規(guī)方法培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304（購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3-4d換液傳代一次。實(shí)驗(yàn)時采用對數(shù)生長期細(xì)胞。傳代時先倒掉舊培養(yǎng)液，用pbs５ml洗兩遍，再加入0.25%的胰酶+0.01%edta，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后大約半分鐘左右看一次，對著光源觀察瓶底細(xì)胞黏附面是否有裂縫（如有則在顯微鏡下可見細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有大部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形），倒掉，加入含低濃度血清培養(yǎng)液，然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。離心后去除上清液，加全培，再分４瓶，補(bǔ)加培養(yǎng)液。這樣操作步驟可大大簡化，不需要將培養(yǎng)瓶拿出拿進(jìn)操作臺了．
附:消化緩沖液(0.25%)胰蛋白酶： 胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，調(diào)節(jié)至PH 7.6，定容至500ml，22um濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
請傳授養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，第四代時大概可培養(yǎng)出多少細(xì)胞來
我也來談?wù)勎茵B(yǎng)過的細(xì)胞經(jīng)驗(yàn):
我養(yǎng)細(xì)胞肝癌細(xì)胞(H22),是采用體內(nèi)傳代法
把肝癌細(xì)胞(H22)株濃度調(diào)整為2*10 6次方,腹腔內(nèi)接種0.08ml,一般一周內(nèi)即可
見到腹水生成,隨時間推移腹水逐漸增多.
這種方法養(yǎng)細(xì)胞保持細(xì)胞的各種特性,使用方便.
我養(yǎng)的也是vero（非洲綠猴腎cell):貼壁細(xì)胞。
傳代步驟比較傳統(tǒng)：倒掉培養(yǎng)液－>PBS洗2遍－>胰酶0.25%消化－>倒掉胰酶－>加培養(yǎng)基－>用吸管吹打均勻－>分瓶－>放置37度，5%CO2孵箱。
我的體會是（可能有不少不規(guī)范的地方，大家討論，指正）：
1.消化時間和實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度也有很大關(guān)系，我們實(shí)驗(yàn)室條件比較差，不能維持恒溫（不過我想大部分實(shí)驗(yàn)室目前也還是做不到的）。夏天的時候，消化特別快。但是到了冬天，就很慢，要用手捂老半天。
3.消化到什么程度可以，經(jīng)驗(yàn)很重要，如果每瓶消化都要通過顯微鏡觀察來判斷，首先效率太低，而且還很容易消化過頭。對光觀察培養(yǎng)瓶，當(dāng)感覺到有些泛白，瓶角有少許細(xì)胞脫離的時候就可以了，倒掉消化液，用手輕拍培養(yǎng)瓶就能脫離了。
2.我們一般培養(yǎng)的時候，就用5%的小牛血清，只有剛傳代的時候才用10％的。感覺這樣，細(xì)胞不會長的特別快，3-4天換一次液完全沒有問題。
123
？！ by victoh
我說一下我養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP：貼壁細(xì)胞
傳代過程：（以25ml培養(yǎng)瓶為例）
1. 移除舊培養(yǎng)液；
2. 加入1ml PBS或胰酶（0.25%Trypsin+0.02%edta)洗；
3. 加入1ml胰酶消化；
4. 鏡下觀察消化完全后，加入2-3ml培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打使細(xì)胞脫落并分散成單個細(xì)胞；
5. 轉(zhuǎn)移到10ml離心管，800轉(zhuǎn)4度下離心4分鐘，吸去上層液，加入少量培養(yǎng)液，輕輕吹打使均勻；
6. 吸取1ml于新培養(yǎng)瓶中，加入9ml培養(yǎng)液于37度，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)：
1. 培養(yǎng)液為10%胎牛血清（外國產(chǎn)）的RPMI1640，加雙抗（最終100單位）。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)：胎牛血清濃度越高，細(xì)胞貼壁越牢；
2. LNCaP雖然是貼壁細(xì)胞，但貼壁不牢，而細(xì)胞間作用較強(qiáng)，不易分散。因此操作過程中，加PBS和胰酶動作一定要輕要慢，否則細(xì)胞易成片脫落；
3. 消化時加入胰酶后，避免晃動培養(yǎng)瓶，否則細(xì)胞易成片脫落，導(dǎo)致不易消化成單個細(xì)胞。盡可能消化完全（鏡下觀察細(xì)胞成單個圓形，也可置于37度培養(yǎng)箱中消化），這樣才易吹打成單個細(xì)胞；
4. 不要等細(xì)胞長滿再傳代，傳代比例一般一傳三或一傳四，傳代周期一般為一周；
5. 不要用舊瓶舊皿傳代，否則細(xì)胞不貼壁；
6. 傳代后48小時內(nèi)不要動，否則細(xì)胞不易貼壁；
7. 如果只要換液，新培養(yǎng)液最好在37度溫浴，因?yàn)榧永渑囵B(yǎng)液易使細(xì)胞懸浮起來。
我們實(shí)驗(yàn)需要養(yǎng)的是HELF(人胚肺成纖維細(xì)胞),這也是一種貼壁生長的細(xì)胞,所以傳代培養(yǎng)時的大概方法沒有什么不同.但這種細(xì)胞貼壁貼得不是很緊,所以消化過程中有幾點(diǎn)注意事項(xiàng)(本人總結(jié)):
1.當(dāng)?shù)钩鲈信囵B(yǎng)液時,最好將培養(yǎng)瓶反過來,即有細(xì)胞的面朝上.
2.如用EDTA消化,最好先讓其消化3分鐘,后每一兩分鐘看一次.
3.每次看時不要太過晃動瓶子,以防細(xì)胞成片脫落.如果細(xì)胞成片脫落了就比較麻煩了,因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)脫落,就不得不終止消化,但實(shí)際上細(xì)胞與細(xì)胞間的連接并沒有完全斷開,吹打也分不開,那樣分出來的細(xì)胞也就成團(tuán),則不利于細(xì)胞貼壁及生長.
4.如果在終止消化前有細(xì)胞脫落,不要浪費(fèi),先加Hank's液終止消化,然后離心,收集細(xì)胞,再讓其生長.
5.細(xì)胞生長狀態(tài)好時,一般5-7天可以長滿,其間換一次液就可以了.
6.但我也遇到過生長不太好的情況,細(xì)胞長了12天才長滿,且其中有幾天幾乎沒長或出現(xiàn)大量黑色死細(xì)胞團(tuán),這時不要放棄,只要活細(xì)胞不是太少,沒有關(guān)系.之所以長的慢或有死細(xì)胞,大概是消化時EDTA的損傷造成的,細(xì)胞恢復(fù)活性需要一定時間,且一旦活性恢復(fù),細(xì)胞將長得很快.
以上是本人實(shí)驗(yàn)中的一點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn),希望有所幫助.
【專題討論】
我仔細(xì)翻看了一哈，好像說人肝癌BEL-7402細(xì)胞的比較少，我做的就是這種細(xì)胞，下面談?wù)勎业膫鞔襟E：
1. 棄去舊培養(yǎng)液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)面朝上，直接倒掉培養(yǎng)液）。
2.PBS沖輕緩漂洗細(xì)胞兩遍，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。
3 加0.25%胰酶（以蓋滿瓶底為標(biāo)準(zhǔn)）于37度條件下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞解離程度以細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形為準(zhǔn)。
4.直接加含血清的1640培養(yǎng)基（或血清)終止消化。
5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細(xì)胞，動作不宜過猛，防止起泡產(chǎn)生。
5. 離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分鐘），去上清。加入PBS液吹打混勻，再離心一遍。
6. 用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：3傳代！
7.補(bǔ)加培養(yǎng)液至所用培養(yǎng)瓶容積的1/10為準(zhǔn)。
8.送孵箱培養(yǎng)。
【專題討論】
我還做過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的原代及傳代培養(yǎng)，下面談?wù)勎业膫鞔襟E：
1. 棄去舊培養(yǎng)液。
2.D-Hank's液輕緩漂洗細(xì)胞兩遍，盡量洗去殘余血清，棄去D-Hank's液。
3 加0.25%胰酶（以蓋滿瓶底為標(biāo)準(zhǔn)）于37度條件下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，以細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形為準(zhǔn)。
4.直接加含血清的LG-DMEM培養(yǎng)基（或血清)終止消化。
5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細(xì)胞，動作不宜過猛，防止起泡產(chǎn)生。
5. 離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分鐘），去上清。
6.加入D-Hank's液吹打混勻，再離心一遍。
7. 用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：2傳代。
8.補(bǔ)加培養(yǎng)液至所用瓶容積的1/10為準(zhǔn)。
9.送孵箱培養(yǎng)。
我也來說說腫瘤細(xì)胞鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的培養(yǎng)，該細(xì)胞來源于C57B/L6小鼠。
該細(xì)胞比較好養(yǎng)，用10%新生牛血清(國產(chǎn)四季清的）+RPMI1640、5%CO2、37度培養(yǎng)。重要的是無菌操作。用0.25%胰酶消化，含0.02%EDTA。消化步驟如下：棄培養(yǎng)基——用1640洗一遍——棄培養(yǎng)基----加胰酶——鏡下觀察邊晃動——細(xì)胞開始變形即可——棄胰酶-----加含血清的1640吹打———鏡下看成單細(xì)胞懸液----離心---加適量培養(yǎng)基——繼續(xù)培養(yǎng)。
【專題討論】
我和師兄一起做過神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）的培養(yǎng)，下面談一下NSC的傳代步驟：
1.相差顯微鏡下觀察，至細(xì)胞克隆生長較為密集時，開始傳代。
2.機(jī)械分離（因?yàn)镹SC是懸浮生長，可用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞克?。┘?xì)胞克隆，制成單細(xì)胞懸液。
3.轉(zhuǎn)移至離心管離心，1000rpm，離心10min。
4.棄上清，加無血清NSC培養(yǎng)基DMEM/F12(1:1）重懸。
5.1：2傳代，補(bǔ)加培養(yǎng)基。
6.送孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。
我說一下HepG2 2.2.15細(xì)胞，它為轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)液為MEM加10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，380ug/ml G418, 5%CO2、37度培養(yǎng),細(xì)胞生長較慢，3天傳代一次。0.3%胰酶消化，該細(xì)胞不容易消化，易抱團(tuán)，我是加胰酶37度2分鐘，倒掉胰酶，將培養(yǎng)瓶倒置4分鐘再加入培養(yǎng)液，吹打重懸。
S9混合液輔助因子有哪些？
內(nèi)皮細(xì)胞瓶底的數(shù)量嘍，滿了就傳代，要不然，細(xì)胞要自殺的，
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
出處：西京醫(yī)院婦產(chǎn)科 --醫(yī)海拾貝
一、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念
細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞摹擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使期生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個細(xì)胞或細(xì)胞群。
在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的是外周血淋巴細(xì)胞、皮膚或纖維細(xì)胞和各種能在體外長期生長的細(xì)胞系。外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)具有時間短、技術(shù)簡便、可重復(fù)取材等優(yōu)點(diǎn)，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細(xì)胞株可在培養(yǎng)過程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化，成為永久細(xì)胞系，也可直接建成永久細(xì)胞系，永久細(xì)胞系能在體外無取制的傳代和生長。永久細(xì)胞系通常具有非整倍體細(xì)胞和各個細(xì)胞的核型不完全相同特征。但細(xì)胞克隆的細(xì)胞系其這一特征可以不明顯。
二、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境
細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。
1、無污染環(huán)境
培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。
2、恒定的溫度
維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng)，溫度上升不超過39℃時，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1小時，細(xì)胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1小時，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1小時，細(xì)胞全部死亡。
3、氣體環(huán)境
氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。
二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。有資料顯示，原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)PH6.8時最適。
細(xì)胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因?yàn)镹aHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細(xì)胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，其最大優(yōu)點(diǎn)是在開放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時能維持較恒定的PH值。
4、細(xì)胞培養(yǎng)基
培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。
（1）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機(jī)鹽、維生素、微量無素和細(xì)胞生長因子等。單獨(dú)使用細(xì)胞雖有生存但不能很好的生長增殖。
（2）天然培養(yǎng)基：使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合志培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長。常見使用最為5-20%。
三、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件
1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)
細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)工作包括：工作液配制、無菌操作（采樣）、溫育、無菌處理，細(xì)胞和用品貯存等。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。
2、常用設(shè)施及設(shè)備
（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。
（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩部間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。
（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。
（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。
（5）分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。
3、培養(yǎng)器皿
細(xì)胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主，常準(zhǔn)備最需是使用最的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。
（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常以500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。
（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種。用于外周血培養(yǎng)的常用10ml普通圓瓶。兩種培養(yǎng)瓶均要求選用優(yōu)質(zhì)玻璃制成。
（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm等幾種。
（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。
（5）離心管：離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml和5ml。
（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。
四、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)
體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時能貼附在支技物表面生長。如羊水細(xì)胞為貼附型細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長。
1、成纖維型細(xì)胞
在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時，皆可稱之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細(xì)胞中央有卵園形核，胞質(zhì)向外伸出2-3厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長。
2、上皮型細(xì)胞
此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征，細(xì)胞中央有園形核，細(xì)胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細(xì)胞培養(yǎng)時，皆呈上皮型形態(tài)生長。
3、游走型細(xì)胞
本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)膩包形態(tài)。常見于羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期。
五、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分析
培養(yǎng)細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長期常有1-2個核仁在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時，細(xì)胞輪廓會增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔泡等，表明細(xì)胞代謝不良。
六、培養(yǎng)用品的清洗與消毒
目前我國細(xì)胞培養(yǎng)器皿主要仍使用能反復(fù)使用的玻璃器皿，清洗的主要目的為清除雜質(zhì)和微生物，使在器皿內(nèi)不殘留任何影響細(xì)胞生長的成份。因而在組織細(xì)胞培養(yǎng)中清洗和消毒是一項(xiàng)極為重要的環(huán)節(jié)。
（一） 清洗
在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長。因此對新使用和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴(yán)格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。
1、玻璃器皿的清洗
組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。
（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應(yīng)先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液（5）浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。
（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。
（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。清潔液去污能力很強(qiáng)。是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應(yīng)少于6小時。 清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強(qiáng)度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） （A）強(qiáng)清潔液 63 1000 200000 B）次強(qiáng)清洗液 120 200 1000 （C）弱清潔液 100 100 100
清潔液配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。
（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。
2、膠塞的清洗
細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。
3、塑料制品的清洗
塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。
（二）消毒
細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。
消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過渣等）。 （B） 化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）。 （C） 抗生素。
（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5米，且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
（2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀?，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫?zé)嵯緯r，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險(xiǎn)，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時檢驗(yàn)安全閥活動自如，繼后開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。
常用物品消毒壓力及時間：
培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘；
布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。
上兩種是最常見的物理消毒方法。
（3）化學(xué)消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?；瘜W(xué)消毒法操作簡單、方便有效。
（4）抗生素消毒：確切應(yīng)記成抗生素滅菌，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。
七、絨毛染色體制備
絨毛來源于胚胎的中胚層，最早的初級干絨毛出現(xiàn)于孕三周初，孕8周左右是絨毛發(fā)育最旺盛時期。目前國內(nèi)外絨毛取材多選于8-9周。研究資料表明，絨毛取樣不影響胚胎的發(fā)育及胎盤的功能。但取樣的失敗可導(dǎo)致胚胎丟失而終止妊娠。
絨毛取樣前者首先要檢查陰道分泌物以判別陰道的潔凈度，防止取樣導(dǎo)致宮內(nèi)感染。其次需做B超檢查，一是確定胚胎大小，二是確定胚芽有無心血管搏動，三是確定胚芽在子宮內(nèi)的位置，用以判別取材時間，是否取材及取樣器進(jìn)宮的角度及深度。
1、 實(shí)驗(yàn)材料
婦科陰道沖洗物品、絨毛取樣器、5ml注射器、培養(yǎng)皿、小鑷子、5ml離心管、甲酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、載玻片等。
2、 培養(yǎng)液配制
PRMI 1640 10-15ml
秋水仙素10ug/ml 1ml
3、 操作過程
（1）1‰新潔而滅沖洗陰道，用卵圓鉗固定子宮頸，根據(jù)婦查及B超提示選擇角度及濃度探性插入絨毛取樣器，當(dāng)有彈性阻擋感且深度符合B超所示時，抽出取樣器內(nèi)芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此時，注射器內(nèi)可見有血性液體流進(jìn)；
（2）取一干凈培養(yǎng)皿，內(nèi)加PRNI 1640 5ml，內(nèi)含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取樣器，將所吸出物注入培養(yǎng)皿內(nèi)，并用1640沖洗注射器及取樣器，混勻。置培養(yǎng)箱30-40分鐘；（3）挑選發(fā)育良好的絨毛放入另一小培養(yǎng)皿中，用預(yù)溫37℃的0.075M。KCL與10%檸檬酸鈉1∶1混合液漂洗兩次。（4）用眼科小剪剪碎絨毛，再將2滴秋堿加入上途漂洗低滲液低滲30分鐘；（5）加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml，預(yù)固定，1000rpm8分鐘，棄上清液；（6）加新鮮配制的3∶2固定液3ml；固定30分鐘，2000rpm8分鐘，棄上清液；（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分鐘，2000rpm8分鐘，棄上清液；（8）離心后，加所余體積的60%冰乙酸，打勻，2分鐘后加等量甲醇，打勻，2000rpm8分鐘，棄上清液。（9）3m1 3∶1甲冰固定液過夜，冰水制片；（10）80℃考片2小時，自然冷卻。（11）G分帶處理，觀片。
八、羊水細(xì)胞培養(yǎng)
羊水中含有胎兒脫落的上皮細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)用以分析胎兒染色體核型。目前國內(nèi)外大都采用腹腔羊膜穿刺術(shù)，妊娠12-30周的羊水細(xì)胞均可培養(yǎng)成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析，最佳孕周為16周左右。因此時羊水增長快，羊水中細(xì)胞較多，細(xì)胞培養(yǎng)易于生長，而且不易損傷胎兒。國內(nèi)多數(shù)選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。國外現(xiàn)已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計(jì)算（1ml/w）。資料表明，穿刺病例的妊娠結(jié)局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。
1、實(shí)驗(yàn)材料
2,5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養(yǎng)皿、蓋玻片等。
2、培養(yǎng)液配制
F-12 85%
小牛血清 15%
雙抗 100u/ml
小瓶貯藏 4-8℃
3、操作過程
A（蓋玻片培養(yǎng)法）
（1）采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中；（2）收集：離心分離細(xì)胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻；（3）接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細(xì)胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘；（4）培養(yǎng)：取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細(xì)胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞生長；（5）終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時；（6）低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細(xì)胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預(yù)固定；（7）固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復(fù)3次；（8）干燥：將附有細(xì)胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中，置80℃烤箱處理2-3小時；（9）膠片：將附有細(xì)胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細(xì)胞破壞；
B（常規(guī)培養(yǎng)法）
（1）—（2）相同于蓋玻片培養(yǎng)法；（3）接種：將混勻的羊水細(xì)胞種置于50ml或100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，平均10ml羊水細(xì)胞收集的細(xì)胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。（4）培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細(xì)胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細(xì)胞生長；（5）終止培養(yǎng)：同A法；（6）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶底面完全接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細(xì)胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細(xì)胞沉慮。若一次消化不徹底，可反復(fù)消化；（7）低滲及預(yù)固定：加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預(yù)固定，用氣泡吹打細(xì)胞使其混勻。（8）固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入；（9）制片及干燥：用絨毛制片；
（10）分帶處理。
九、人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)
在正常情況下，人外周血中是沒有分裂相的，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。植物血球凝集素（PHA）是人類淋巴細(xì)胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下，原處于Go期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行有絲分裂。利用PHA這一特性，淋巴細(xì)胞經(jīng)過含有HPA培養(yǎng)液培養(yǎng)，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細(xì)胞群體，終止分裂中期的淋巴細(xì)胞，例可得到所需的人體染色體圖形。具有用血量少、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。
1、實(shí)驗(yàn)材料
2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽或棉球、鑷子、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、載玻片等。
2、培養(yǎng)液配制
無菌條件下配制培養(yǎng)液，每瓶所含下列試劑：
RPMI 1640或199 90%
小牛血清 10%
PHA（自制） 0.1ml 3%
肝素 10u/ml 2%
雙抗 100u/ml（選擇）
分裝于10ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5ml培養(yǎng)液，封口置冷藏柜備用。
3、操作過程
（1）采樣接種：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶蓋，用酒精燈火焰過烤，無菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，輕搖均勻，盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸；（2）培養(yǎng)：置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每隔12小時左右輕遙1次，以促進(jìn)細(xì)胞生長增殖；（3）抑止分裂：收獲前2小時左右加秋水仙素，最終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以抑止細(xì)胞在分裂中期。（4）終止培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，搖勻后移至10ml尖底離心管中，盡量收集培養(yǎng)細(xì)胞。2000rpm8分鐘。（5）低滲處理：棄上清液，加入預(yù)溫37℃的0.075MKCL8ml，迅速打勻，置37℃培養(yǎng)箱或水浴鍋中10-20分鐘；（6）預(yù)固定：取出低滲中尖底離心管，輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相應(yīng)編號滴管用汽泡輕輕軟打2-3下。800-1000rpm8-10分鐘；（7）固定：棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，輕打混勻，封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘，反復(fù)2-3次；（8）制片：使用蒸餾水制備冰水片進(jìn)行滴片。留離心后沉淀細(xì)胞，加新鮮配制的固定液，制成細(xì)胞懸液，取1-2滴滴片，用于輕輕吹開?？烫柡笄謇砜烫栁畚铮?0℃烤片2小時；（9）收片：待烤箱自然冷卻后，取出烤片，置干凈環(huán)境中或培養(yǎng)箱中以備進(jìn)行顯帶處理。
十、植物油凝素的制備
植物血凝素也稱為植物凝集素（PHA），可自制也可購自商品。自制的方法常用生理鹽水提取法。
（A）干品制備法（1）選廣東雞子豆10g，用蒸餾水沖洗，置培養(yǎng)皿內(nèi)用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留間隙置37℃。恒溫箱內(nèi)24-48小時；（2）在無菌條件下研碎雞子豆，加生理鹽水30ml，搖勻后放入4℃冰箱24小時，第二天再加生理鹽水70ml，再置4℃冰箱內(nèi)24小時。每8-12小時搖蕩一次。（也可一次性加100ml生理鹽水）；（3）無菌條件下移入10-50ml離心管內(nèi)，3000-4000rpm30分鐘。在無菌箱內(nèi)把上清液分裝于10ml小瓶，置冰箱冷凍層備用；（4）效價(jià)：外周血染色體制備每100ml培養(yǎng)基加PHA約2ml。注：若整個過程未在無菌條件下進(jìn)行，分裝時用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鮮品制備法：（1）選擇完整無破皮鮮菜豆20g，用75%酒精浸泡10分鐘；（2）在凈化工作中用無菌鹽水或蒸餾水漂洗二次，然后置無菌乳缽中搗成糊狀，用100ml無菌鹽水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小時，中間搖動數(shù)次，次日3000rpm30分鐘，在無菌情況下分裝上清液于10ml小瓶內(nèi)，置冰箱冷凍層備用。（4）效價(jià)：正式使用前先用一定量作效價(jià)測定，按效價(jià)使用。
十一、組織培養(yǎng)細(xì)胞染色體制備
組織細(xì)胞用于遺傳學(xué)分析最常見的是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株，多為惡性腫瘤細(xì)胞株，且呈貼壁生長，僅小數(shù)細(xì)胞株為懸浮生長。培養(yǎng)細(xì)胞有來源易得、細(xì)胞分裂率高和染色體標(biāo)本制出清晰度高等優(yōu)點(diǎn)。組織細(xì)胞染色體制備的關(guān)鍵是掌握好體外細(xì)胞的生長動態(tài)，只有處在對數(shù)生長期的細(xì)胞才能出現(xiàn)較高的分裂相，所以積水仙素處理的時機(jī)及量是染色體標(biāo)本形態(tài)及分裂指數(shù)的關(guān)鍵。
1、 實(shí)驗(yàn)材料
培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度離心管，直吸管及彎頭吸管，培養(yǎng)瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。
2、 培養(yǎng)液配制
培養(yǎng)液 85-95%
小牛血清 5-15%
雙抗（選擇） 100u/ml
3、 操作過程
（1）培養(yǎng)細(xì)胞：選擇處于指數(shù)生長期、用大瓶培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞；
（2）終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養(yǎng)混合液，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時以抑制分裂期細(xì)胞停止于分裂中期；（3）聚集細(xì)胞：
（A） 搖動法：
可利用分裂中期細(xì)胞變圓與底物附著不牢特點(diǎn)，此時可持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動，可使90%的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落；
（B） 消化法：
將培養(yǎng)液倒入離心管內(nèi)，給培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右搖動，便培養(yǎng)瓶底壁面完全接觸消化酶，稍后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞完全脫落后，加入3-5ml前培養(yǎng)終止消化。用吸管移入裝有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)2000rpm10分鐘。棄上清液，留沉淀細(xì)胞；
（4）低滲處理：給沉淀細(xì)胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均勻，在溫箱中靜置20-30分鐘；
（5）預(yù)固定：向低滲處理適當(dāng)?shù)碾x心管中加新鮮配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管輕松吹打調(diào)勻，此措施能起到使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。
（6）固定：800-1000rpm10分鐘，棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入時要沿管壁慢慢加入，后輕輕吹打，封口后室溫靜置30分鐘以上，反復(fù)三次；
（7）制片：末次離心后，倒掉上清液，留沉淀細(xì)胞，加新鮮配制固定液0.5ml左右，混勻后冰片制片，其它同外周血方法。
十二、胸腹水細(xì)胞染色體制備
在惡性腫瘤的胸腹水中有大量的分裂期細(xì)胞，其中多以非整倍體細(xì)胞存在，并含有各種標(biāo)記染色體。
1、 實(shí)驗(yàn)材料
2.5%碘精、75%酒精、無菌棉球、鑷子20-22號無菌腰穿包、50ml離心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片等。
2、 操作過程
（1）采樣：選擇有胸或腹水患者，在無菌條件下，輕腹穿刺或于手術(shù)取胸或腹水20-50ml；
（2）培養(yǎng)：立即加入秋水仙素培養(yǎng)，最終濃度為0.02-0.04ug/ml胸腹水，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)4-6小時；
（3）低滲及后期制作羊水細(xì)胞。
十三、染色體制備體會
1、 培養(yǎng)基PH濃度、小牛血清量及培養(yǎng)箱溫度的恒定是培養(yǎng)成功關(guān)鍵；
2、秋水仙素適量、適宜的處理時機(jī)和時間，是獲得良好、足夠分裂相的條件。分裂相的多少和染色體形態(tài)及帶型處理良好與否均受其影響。
3、低滲處理是獲得分散良好的分裂相關(guān)鍵步驟，低滲過度或不足都會造成染色體形態(tài)不良的結(jié)果。在低滲處理時期細(xì)胞十分嬌嫩，并且表面發(fā)粘，低滲細(xì)胞混勻時，吹打要適宜，避免細(xì)胞破碎及粘團(tuán)，另外不要將細(xì)胞吸到吸管上部及離心管上部，避免細(xì)胞丟失。
4、固定技術(shù)是制備良好分散的染色體的重要步驟。若染色體分?jǐn)?shù)不良，可適當(dāng)加大冰乙酸含量，其同時有改善由于低滲處理不夠或固定不充分所造成的缺陷，但過量會造成染色體形態(tài)變化和影響分帶結(jié)局。染色體形態(tài)不良與固定液速度有關(guān)，加第1次固定液過快或打過快，可造成飄帶樣染色體； 5、固定液每次使用必須新鮮配制，否則將會形成酯類，從而影響固定效果。6、滴片是染色體制備中影響染色體形態(tài)的關(guān)鍵一步。首先要載玻片要非常干凈，否則會影響染色體的分散和分帶效果。其次是滴片的距離、滴加量多少、制片的方式都會影響染色體分期效果。 7、烤片：是染色體制備中最后一步技術(shù)?？酒臏囟?、時間與染色體形態(tài)和分帶有關(guān)。不宜溫度過高和烤片時間過長。
十四、染色體實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析
染色體分裂指數(shù)低：患者處于非常時期（感染期、放、化療期）：
培養(yǎng)基營養(yǎng)成份不良；
培養(yǎng)基PH偏低或偏高；
PHA過量或不足；
小牛血清質(zhì)量不高；
小牛血清數(shù)量偏低或過高；
培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定；
培養(yǎng)箱溫度偏低；
秋水仙素處理時間過短；
離心時間或速度不足；
制備過程損失過大。
染色體形態(tài)不理想：受檢者處于非常時期；
PHA過量；
小牛血清質(zhì)量不高；
培養(yǎng)箱溫度不恒溫；
秋水仙素量不當(dāng)；
低滲時間不理想；
低滲溫度過高；
離心速度過高；
固定液加速過快；
固定混勻手法過重；
吹片技術(shù)不良。
染色體形態(tài)偏長： 培養(yǎng)基PH偏酸；
秋水仙素量偏低；
秋水仙素處理時間偏短；
染色體形態(tài)偏短： 培養(yǎng)基PH偏堿；
秋水仙紗處理量過量；
秋水仙素處理時間過長。
染色體分帶不良： 血液狀況不良；
培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不良；
小牛血清質(zhì)量不高；
小牛血清數(shù)量不當(dāng)；
培養(yǎng)箱培養(yǎng)溫度不良；
秋水仙素處理量過高；
PHA量過高；
低滲處理時間或溫度不良；
胰酶質(zhì)量不良；
染色液質(zhì)量不良；
染色技術(shù)不良；
分帶技術(shù)不佳。
染色背景不良： 培養(yǎng)細(xì)胞生長不良；
低滲處理技術(shù)不良；
離心過程塵染；
分帶技術(shù)不良；
染色技術(shù)不良；
染色液塵染；
載玻片處理不干凈；
制片過程塵染；
存片環(huán)境不干凈。
培養(yǎng)失敗： 培養(yǎng)中損失；
血源質(zhì)量不良；
培養(yǎng)中感染；
小牛血清污染；
培養(yǎng)箱溫度失控；
PHA過期或過量；
秋水仙素失效；
低滲失敗；
離心機(jī)失誤。
標(biāo)本損失： 培養(yǎng)中損失；
制備中損失；
分帶中損失；
保存中損失；
十五、染色體分帶技術(shù)
染色體顯帶技術(shù)是在顯示染色體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是能顯現(xiàn)染色體本身更細(xì)微的結(jié)構(gòu)，有助于更準(zhǔn)確地識別每條染色體及染色體異常疾病。染色體分帶技術(shù)能適用于各種細(xì)胞染色體標(biāo)本。
染色體顯帶是沿著整條染色體的長軸，能顯現(xiàn)出著色深淺不同、橫向走的帶型。目前認(rèn)為染色體顯帶現(xiàn)象是染色體結(jié)構(gòu)所致。但用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶型更加清晰，隨顯帶方法不同，顯現(xiàn)出的帶型的特點(diǎn)也不一樣，這說明帶的出現(xiàn)與染料的特異結(jié)合相關(guān)。人類染色體能顯現(xiàn)出近2000個G帶，這些帶再融合成一般顯微鏡下可見的850條左右的高分辯染色體帶型或350條帶左右的常規(guī)帶型。
常見的幾咱顯帶方法：
（一）、G帶
也稱為G顯帶，是最常用的顯帶方法，具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)及標(biāo)本能長期保存等優(yōu)點(diǎn)。
1、Giemsa原液的配制：
（1）稱3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少許丙三醇研磨，研磨越細(xì)越好；
（2）將研細(xì)的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶內(nèi)，丙三醇的總量為250ml，用一定量甲醇洗干凈研磨器。
（3）搖勻，置60℃水浴鍋24小時或37℃溫箱72小時，經(jīng)常搖動。
（4）取出冷卻后，加甲醇總量至250ml混勻，密封棕色瓶備用。貯藏時間越長，染色效果越好。
2、實(shí)驗(yàn)材料：
中期染色體標(biāo)本；
0.9%氯化鈉注射水；
3%tris液體；
0.25%胰蛋白酶；
Gremsa染色液；
蒸餾水；
水浴鍋；
立式染缸；
定時器或時針；
溫度計(jì)；
鑷子及紗布；
刻字筆；
3、操作程序：
（1）消化液配制：取0.9%氯化鈉注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶鹽水消化液，加4-5滴tris液調(diào)PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴鍋中備用；
（2）染液配制：取立式染缸，加蒸餾水500ml，加3滴tris液調(diào)PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管調(diào)勻備用；
（3）漂洗液：取立式染缸一個，內(nèi)加蒸餾水備用；
（4）試消化：待消化液溫度在37℃左右時，取同批標(biāo)本較多者標(biāo)本1張，分二節(jié)或三節(jié)進(jìn)行消化，每節(jié)相差十五秒左右，從45秒或60秒開始增減。取出后先在紗布或吸水紙上直立除去帶出胰蛋白酶，后置蒸餾水染缸內(nèi)漂洗，取出后，標(biāo)本斜面朝上，刮去染色缸內(nèi)染液上浮膜，沿槽插入，每分鐘移動1次，染色3-5分鐘。
（5）洗片：從染色缸中取出標(biāo)本玻片，自來水沖洗，取刻編號面朝上用紗布干凈玻片背部染色，稍干，高倍鏡下觀片，確定分帶與染色時間。
（6）分帶：取4張待分帶標(biāo)本玻片，細(xì)胞面朝左側(cè)按順序插入37℃的消化液中，消化時間較試消化選擇時間延長5-10秒鐘，取出每片間隔時間約10秒鐘左右。
（7）消化及染色調(diào)整：每次消化完一批標(biāo)本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化時間不變。同樣，每次染色一批標(biāo)本后加Giemsa染色液2-3滴，調(diào)勻，每次染色時間不變；
（8）Giemsa染色調(diào)整：若Giemsa染色標(biāo)本偏紅，說明染色液偏酸，可加tris數(shù)滴調(diào)藍(lán)，若Gremsa染色標(biāo)本偏藍(lán)則說明tris加多了；
（9）保存：將分好帶的及觀察中的標(biāo)本及時收集于玻片盒內(nèi)保存，防止細(xì)胞涂面灰塵污染及擦損。
注意：Giemsa消化染色過程中，有兩個重要的環(huán)節(jié)，一是胰酶消化環(huán)節(jié)，消化不足帶不出現(xiàn)，消化過度染色體變得膨脹和不著色，必須把握好胰酶濃度、消化時間和消化溫度；二是預(yù)處理或老化環(huán)節(jié)，對消化和帶型清晰度有很大影響，其中80℃2小時熱處理，是簡便易行和效果較好的辦法。
（二）姐妹染色單體分化染色
姐妹染色單體差別染色可使中期染色體顯示深淺不同的兩條單體，能借以觀察姐妹染色單體互換（SCE）現(xiàn)象。SCE是兩條染色單體在DNA合成中核苷酸序列發(fā)生互換而表現(xiàn)出來一種現(xiàn)象。即是細(xì)胞分裂是DNA同源重組的結(jié)果。SCE既是一種無害的變化（有生理波動），也可受射線、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映細(xì)胞的損傷與修復(fù)狀態(tài)。
1、原理：
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入一定是的5-溴脫氧尿苷（BudR ）,當(dāng)細(xì)胞在DNA復(fù)制過程時，BudR能作為核苷酸的前體取代胸腺嘧啶而被摻入到新合DNA中。因此，當(dāng)細(xì)胞處于第二個分裂周期時，同一染色體的兩條姐妹染色單體，一條由雙股都含有BudR的DNA鏈構(gòu)成，而另一條為單股含有BudR的DNA鏈。在結(jié)構(gòu)上雙股含BudR的DNA螺旋化程度較低，故對染色劑親合力低，在用Giemsa染色時其單體著色淺，只有單股含BudR的DNA鏈組成的單體則著色深而形成差別著色。
2、BudR貯存液的配制：
BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）
然后加蒸餾水至 5ml
即成1000ug/ml的貯存液，因BudR遇光會發(fā)生分解，貯存液需置棕色瓶并黑紙封瓶避光冰凍保存。
3、實(shí)驗(yàn)材料：
所檢培養(yǎng)細(xì)胞；
BudR貯存液；
2×SSC液；
常規(guī)染色體制片所需物品；
水浴鍋；
20W紫外燈一個；
培養(yǎng)皿；
鏡頭紙；
4、操作程序
（1）BudR摻入：細(xì)胞培養(yǎng)24小時后于培養(yǎng)液中加入BudR，最終濃度5-15mg/ml，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
（2）終止培養(yǎng)：待細(xì)胞經(jīng)歷兩個細(xì)胞周期（48小時），培養(yǎng)終止前3小時加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液；
（3）常規(guī)制片及烤片；
（4）紫外燈照射：取標(biāo)本玻片置于大號培養(yǎng)皿內(nèi)，正面朝上，上覆蓋鏡頭紙，從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕，移入50-60℃水浴鍋內(nèi)，紫外線燈距離5cm，照射30-40分鐘；
（5）染色：取出照射后標(biāo)本，蒸餾水沖洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分鐘；
（6）洗片及存片：同G帶片
注意：BudR是一種強(qiáng)突變劑，使用濃度不宜過高，否則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。
（三）染色體脆性部位（fra）
脆性位點(diǎn)也稱危性部位，是在一定的培養(yǎng)條件下人類染色體上某些特異位點(diǎn)非隨機(jī)地表現(xiàn)出的裂隙和斷裂。脆性部位分為普通型和罕見型兩大類。
1、實(shí)驗(yàn)材料
（1）常規(guī)外周血所用物品。
（2）培養(yǎng)基是用不含葉酸的MEM-Fra培養(yǎng)基或低葉酸的CT199培養(yǎng)基。
2、培養(yǎng)液配制
MEM-Fra 90-95%
小牛血清 5-10%
雙抗 100u/ml
PH調(diào)至7.5左右
3、操作程序
與制備外周血的染色體方法相同。
注：脆性X綜合癥：（FraX）
這種染色體改變是在1969年被發(fā)現(xiàn)，1977年被定位于Xq27、記錄為fra（X）（q），并命名為脆性部位。X連鎖智力低下（MR）與fra（X）（q27）密切相關(guān)。FraX的發(fā)生率占新生兒的1/2500；占X連鎖MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其發(fā)生率僅次于先天愚型
我也來說說，我培養(yǎng)的是人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，原代時間較長，關(guān)于胰酶與EDTA比例的問題，我們實(shí)驗(yàn)室有兩種做法，一個是1：1地加入，另一個是保證胰酶中濃度0.25，EDTA終濃度0.02（混合液中）
LONZA特殊無血清培養(yǎng)基 （點(diǎn)擊進(jìn)入）
詳情煩下載附件
|
