其實(shí)這個(gè)東西分子克隆上寫(xiě)得很清楚，照著走應(yīng)該是可以出結(jié)果的。但現(xiàn)在許多人不看書(shū)，只上網(wǎng)。
脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）的原理大致為:
細(xì)菌包埋于瓊脂塊中,用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體進(jìn)行酶切,酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過(guò)電場(chǎng)方向不斷交替變換及合適的脈沖時(shí)間等條件下而得到良好的分離。
ＰＦＧＥ中內(nèi)切酶的選用至關(guān)重要,所采用的內(nèi)切酶常為寡切點(diǎn)酶(ｌｏｗｆｒｅｑｕｅｎｃｙｃｌｅａｖａｇｅｒｅｓｔｒｉｃ-ｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ),這種酶切后的片段少而大,適合于作ＰＦＧＥ電泳。ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ等[8]通過(guò)對(duì)細(xì)菌的ＰＦＧＥ電泳圖譜的內(nèi)切酶的選擇研究發(fā)現(xiàn),四核苷酸ＣＴＡＧ在許多ＧＣ含量>45%的細(xì)菌染色體中是很少見(jiàn)的,在他們所試驗(yàn)的16個(gè)細(xì)菌的染色體中,被1個(gè)或多個(gè)可識(shí)別ＣＴＡＧ位點(diǎn)的內(nèi)切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,這些酶的識(shí)別序列分別為:ＸｂａⅠ(ＴＣＴＡＧＡ),ＳｅｐⅠ(ＡＣＴＡＧＴ),ＡｖｒⅡ(ＣＣＴＡＧＧ)和ＮｈｅⅠ(ＧＣＴＡＧＣ)。同樣地,在許多含Ｇ+Ｃ<45%的基因組,ＣＣＧ和ＣＧＧ更少。這樣用ＳｍａⅠ(ＣＣＣＧＧＧ)、ＲｓｒⅡ(ＣＧＧＷＣＣＧ)、ＮａｅⅠ(ＧＣＣＧＧＣ)和ＳａｃⅡ(ＣＣＧＣＧＧ)進(jìn)行酶切,對(duì)產(chǎn)生平均超過(guò)100000ｂｐｓ片段是非常合適的。
對(duì)ＰＦＧＥ結(jié)果的觀(guān)察,可因不同研究者而出現(xiàn)較大差異,據(jù)此,Ｔｅｎｏｖｅｒ等[6]經(jīng)過(guò)多年的研究提出了ＰＦＧＥ的解釋標(biāo)準(zhǔn):(1)相同(ｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ):酶切圖譜間有同樣的條帶數(shù),且相應(yīng)條帶大小相同,流行病學(xué)上則認(rèn)為相同,這種經(jīng)ＰＦＧＥ證實(shí)的結(jié)果,用其它方法檢測(cè)不可能顯示實(shí)質(zhì)性的差異。(2)緊密相關(guān)(ｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄ):ＰＦＧＥ試驗(yàn)中,其它克隆株與暴發(fā)克隆株有一致的單一基因事件的改變,如點(diǎn)突變、插入或ＤＮＡ缺失。典型的情況下,這種變化可導(dǎo)致2～3條帶的差異,當(dāng)一些分離菌株被多次重復(fù)培養(yǎng)或自同一病人多次分離時(shí)可觀(guān)察到這種現(xiàn)象。(3)可能相關(guān)(ｐｏｓｓｉｂｌｙｒｅｌａｔｅｄ):兩個(gè)獨(dú)立的基因情況所致的一致的差異,如出現(xiàn)了4～6條帶差異,此時(shí)能用簡(jiǎn)單的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位點(diǎn)的獲得或缺失來(lái)解釋。這些菌株與暴發(fā)株間遺傳基因不緊密相關(guān),流行病學(xué)上也不大可能相關(guān),在長(zhǎng)于6個(gè)月時(shí)間及大范圍的暴發(fā)中收集的菌株可出現(xiàn)這類(lèi)情況。(4)不相關(guān)(ｕｎｒｅｌａｔｅｄ):1個(gè)分離菌株通過(guò)3個(gè)更多個(gè)獨(dú)立的基因事件所致的一致的改變,其ＰＦＧＥ圖譜與暴發(fā)克隆株樣式不同,則可認(rèn)為與暴發(fā)克隆株不相關(guān)(一般總有7個(gè)或更多個(gè)條帶的差異)。典型情況下,這一分離株常只有少于50%的良好的分離的片段出現(xiàn)在暴發(fā)株圖譜樣式中。 |
